大豆MADS-box家族两个基因功能的初步研究

论文摘要

在植物的许多发育阶段,MADS-box家族基因都扮演了重要的角色。它控制了植物的花器官发育,在植物侧根,果实,种皮的发育过程中也起了很重要的作用。拟南芥中报道的MADS-box基因有107个,而在大豆中还知之甚少。GmMADS28及GmAGL15是MADS-box家族基因两个重要成员,GmMADS28在花中优势表达,序列分析和系统发生分析表明是SEP亚家族成员,GmAGL15在幼胚中表达量较高。本研究对这两个基因进行了初步的研究。为了研究GmAGL15基因功能,首先本实验利用洋葱表皮对GmAGL15进行了亚细胞定位,发现其定位于细胞核和细胞膜。对其进行序列比对与系统发生分析,发现GmAGL15与拟南芥的AGL15相似性较高,达69%。该基因的基因组结构的分析表明它们都含有7个内含子,蛋白的N,C末端都含有一段保守序列,推测GmAGL15基因与拟南芥AGL15同源。为探明大豆GmAGL15基因的表达调控规律,应用电子克隆技术从大豆基因组中克隆了GmAGL15翻译启始位点上游1000bp的DNA片段,用PLACE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-BOX、CAAT-BOX。另外还含有一些顺式作用元件,如调控GmAGL15的组织特异的和特定发育阶段的表达,对胁迫的应答,光调节,以及反馈调节,推测大豆GmAGL15基因表达有相应组织特异性,可能受蔗糖、生长素和乙烯等的调控。用PLACE在线启动子预测工具对大豆与拟南芥等其他4种植物的同源基因启动子的顺式元件进行统计比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了GmAGL15基因表达调控的精确性或多样性。本研究还初步进行了GmAGL15基因在烟草中的异位表达,并对转化植株的基因表达进行了荧光定量检测,表明该基因得到了表达,但是植株与对照相比无明显表型变化。为了研究GmMADS28基因功能,本实验利用农杆菌介导法初步进行了GmMADS28基因在大豆中的增强表达,获得了62株抗性植株,发现少数有提早开花现象。同时应用Gateway技术体系替代传统载体的构建方法,并结合近年来广泛应用于植物基因功能研究的RNA干涉技术,构建了大豆基因GmMADS28的RNA干涉载体,并转化了根癌农杆菌,为下一步的转基因研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表及其英汉对照
• 第一章 文献综述
• 1.1 MADS-BOX基因家族研究进展
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 MADS-box基因家族与种子发育过程
• 1.1.3 MADS-box基因在花发育过程中作用
• 1.1.4 大豆MADS-box基因的研究进展
• 1.2 RNA干涉的原理及应用
• 1.2.1 RNA干涉技术的作用机制
• 1.2.2 RNA干涉技术的特征
• 1.2.3 RNA干涉技术在植物基因功能研究中的应用
• 1.2.4 应用RNA干涉技术构建高效植物干扰载体
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 GMAGL15基因的初步分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料与菌株
• 2.1.2 大豆GmAGL15基因亚细胞定位
• 2.1.3 序列来源
• 2.1.4 大豆GmAGL15多序列比对与系统发生分析
• 2.1.5 启动子的获得及分析
• 2.1.6 烟草转基因及检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 大豆GmAGL15的亚细胞定位
• 2.2.2 GmAGL15基因的基因组结构
• 2.2.3 大豆GmAGL15多序列比对与系统发生分析
• 2.2.4 大豆GmAGL15的启动子的获得和顺式元件分析
• 2.2.5 大豆GmAGL15与其他物种的同源基因启动子序列的比较
• 2.2.6 GmAGL15基因在烟草中的异位表达
• 2.2.7 转GmAGL15基因烟草的PCR检测
• 2.2.8 转GmAGL15基因烟草中基因表达的荧光定量PCR检测
• 2.3 讨论
• 第三章 GMMADS28基因功能的初步研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 试剂及仪器设备
• 3.1.4 大豆的子叶节遗传转化
• 3.1.5 RNAi目标区段选择及引物设计
• 3.1.6 利用Gateway技术构建RNAi载体
• 3.1.7 植物表达载体的转化
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 大豆的转化及再生
• 3.2.2 RNA干涉区段选择与PCR引物设计
• 3.2.3 GmMADS28干扰片段的克隆及BP反应
• 3.2.4 LR反应及阳性克隆检测
• 3.2.5 表达载体转化农杆菌的检测
• 3.3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢