CAEV p28蛋白的原核表达及CAEV感染山羊卵巢颗粒细胞的研究

论文摘要

山羊关节炎-脑炎（Caprine Arthritis Encephalitis,CAE）是由反转录病霉科慢病毒属山羊关节炎-脑炎病毒（Caprine Arthritis Encephalitis Virus,CAEV）引起的山羊的慢性传染病。CAE的典型症状是山羊羔脑脊髓炎和成年山羊多发性关节炎、硬结性乳房炎以及间质性肺炎。该病呈全球分布,英国、美国等发达国家更为严重,我国于1982年进口种山羊时传入本病,该病对山羊种群造成的经济损失是惨重的。但是目前,对该病的预防与控制仍是世界各国所面临的难题。为了在我国更好地预防和控制本病的发生和流行,建立一种快速、简单、可靠的检测CAEV的诊断方法,本试验在大肠杆菌中诱导表达了CAEV p28特异性蛋白,并用该蛋白作抗原建立了间接ELISA检测方法,用该方法对100份本室保存血清进行了检测。首先使用山羊关节滑膜细胞成功繁殖了山羊关节炎-脑炎病毒后,参照GenBank发表的基因序列,设计合成一对带有酶切位点的引物,对CAEV甘肃株p28基因进行PCR扩增,并进行了分子克隆,利用pET表达载体成功实现了p28基因在大肠杆菌中的表达。重组蛋白氨基端带有6个组氨酸标签,利用固定化金属离子亲和层析法进行纯化,免疫印迹试验证明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原建立了间接ELISA诊断方法,确定其最佳工作条件为重组抗原每孔包被0.1μg,阳性血清以1:50倍稀释,辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG（HRP-兔抗山羊IgG）以1:1000倍稀释,HRP-兔抗山羊IgG最佳作用时间为2h,判定标准为P/N值人于2,且OD值在1.0左右的血清为阳性,否则判为阴性;同时用纯化的p28蛋白免疫小鼠,制备阳性血清。利用重组蛋白抗原检测3只CAEV攻毒后山羊血清抗体水平时发现,3只山羊均在接种2周后可产生p28蛋白的相应抗体,此抗体一直持续存在且滴度较高。在分别以p28蛋白做抗原的琼脂糖免疫扩散试验（AGID）结果和间接ELISA试验结果对比中发现,攻毒山羊在接种5周后用两种方法都可检测到血清抗体,但琼扩方法检测到抗体的最早时间比ELISA方法检测到抗体的最早时间要迟3周,而且琼扩方法在检测攻毒后第6个月山羊血清时为阴性,而ELISA方法检测结果为阳性,一方面说明表达的p28蛋白抗原性好,另一方面也说明用琼扩方法能够检测到的p28抗体水平要比ELISA方法能够检测到的p28抗体水平高,ELISA诊断方法比琼扩诊断方法有高的敏感性。重组抗原在实际应用中共检测100份血清样品,67份抗体检测呈阳性。我们知道CAEV能够在山羊关节滑膜、胎肺、眼角膜细胞上繁殖,但最近国外有报道称:CAEV在山羊卵巢颗粒细胞上也能够繁殖,而且山羊卵巢颗粒细胞经常被用于体外卵母细胞成熟,同时几乎所有的工业化国家山羊种群都高度感染CAEV,而且许多不明来源的卵母细胞被用作体外山羊胚胎生产,所以我们认为作为饲养层细胞的颗粒细胞可能是山羊胚胎感染CAEV的主要来源,因此,颗粒细胞能否被CAEV感染是我们确定山羊胚胎感染CAEV的途径提供一条新的线索。为此,本研究进行了CAEV在山羊卵巢颗粒细胞上的感染性试验。对山羊卵巢颗粒细胞进行原代培养,传代2-3代以后,接种CAEV,观察细胞病变,提取病变细胞核酸后,用设计好的的针对CAEV p28基因的引物进行PCR扩增,扩增出一条660bp的片段,经过序列分析后,确定为p28基因,证明CAEV基因组已整合到颗粒细胞基因组上;用上面试验中制备的p28蛋白免疫小鼠获得的阳性血清对病毒在颗粒细胞上的培养物进行CAEV特异性蛋白的免疫印迹试验,发现培养物中有CAEV特异性p28蛋白,证实整合到颗

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摘要

ABSTRACT

1.引言

1.1 山羊关节炎-脑炎病毒的概述

1.2 山羊关节炎-脑炎病毒基因组结构和编码蛋白

1.3 关于p28基因的表达

1.4 山羊关节炎-脑炎的发病机理

1.5 山羊关节炎-脑炎的临床症状

1.6 山羊关节炎-脑炎的病理学特征

1.7 山羊关节炎-脑炎的诊断

1.7.1 临床诊断

1.7.2 实验室诊断

1.7.3 血清学诊断

1.8 本研究的背景、内容及意义

2.材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 病毒

2.1.2 质粒与菌株

2.1.3 实验动物

2.1.4 抗体

2.1.5 主要生化试剂

2.1.6 主要耗材

2.1.7 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 山羊关节滑膜细胞（GSM）的培养及CAEV的繁殖

2.2.2 核心蛋白p28基因的扩增

2.2.3 T-p28重组子的构建

2.2.4 重组表达载体pET30p28的构建与序列分析

2.2.5 阳性重组质粒pET30p28的表达

2.2.6 表达产物的纯化

2.2.7 表达产物的鉴定

2.2.8 用纯化后p28蛋白做抗原的间接ELISA诊断方法的建立

2.2.9 p28蛋白免疫小鼠制备CAEV阳性血清

2.2.10 山羊关节炎-脑炎病毒对卵巢颗粒细胞的感染试验

3.结果

3.1 CAEV的培养

3.2 p28基因的PCR扩增

3.3 T-p28重组子的酶切鉴定

3.4 重组表达载体pET30p28的构建

3.5 重组表达载体pET30p28的序列分析

3.6 p28蛋白的表达与纯化

3.7 重组蛋白抗原性的鉴定

3.7.1 免疫印迹试验

3.7.2 间接ELISA试验

3.8 用纯化后p28蛋白做抗原的间接ELISA诊断方法的建立

3.8.1 重组抗原和阳性血清最佳稀释度的确定

3.8.2 酶标记兔抗山羊IgG最佳稀释度的确定

3.8.3 酶标记兔抗山羊IgG最佳作用时间的确定

3.8.4 敏感性试验

3.8.5 重复性试验

3.8.6 重组抗原的应用

3.9 p28蛋白免疫小鼠阳性血清抗体水平的检测

3.10 CAEV对卵巢颗粒细胞感染性试验

3.10.1 CAEV感染颗粒细胞的病变

3.10.2 感染颗粒细胞中CAEV前病毒的PCR鉴定

3.10.3 感染颗粒细胞中CAEV特异性蛋白的免疫印迹试验

3.10.4 感染颗粒细胞中CAEV在山羊关节滑膜细胞上的病毒滴定

4.讨论

5.结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

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