论文题目: 克拉维酸的检测及棒状链霉菌lat基因的克隆与突变
论文类型: 硕士论文
论文专业: 食品科学
作者: 左志晗
导师: 王艳萍
关键词: 克拉维酸,检测,棒状链霉菌,基因替代,原生质体,转化,单交换
文献来源: 天津科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 克拉维酸是临床上应用最早的一类β-内酰胺酶抑制剂,是β-内酰胺类物质产生菌棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的代谢产物。克拉维酸因其广泛的抑制β-内酰胺酶的活性而具有重要的临床意义及可观的经济价值。 本文以克拉维酸产生菌—棒状链霉菌为研究对象,对棒状链霉菌的发酵产物分别采用了HPLC法、紫外分光光度法及生物检定法进行测定,并对三种检测方法测定结果之间的关系进行了分析,得出三种检测方法测定结果具有相关性。 利用基因替代的方法,将出发菌株—棒状链霉菌基因组DNA上的克拉维酸合成基因簇中编码赖氨酸ε-转胺酶的lat基因进行了改造。在大肠杆菌中构建了重组质粒pKCLES和pKCLHS,它们来自于链霉菌—大肠杆菌穿梭质粒pKC1139,并在多克隆位点区插入失活的lat基因片段;并将质粒pKCLHS转入棒状链霉菌中,获得棒状链霉菌lat基因阻断的突变菌株。 为得到lat基因片段,根据已知的棒状链霉菌编码赖氨酸ε-转胺酶的lat基因的核苷酸序列设计并合成引物,以棒状链霉菌的染色体DNA为模板,经PCR扩增得到了1.8kb的lat基因片段。将1.8kb的lat基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点区,得到重组质粒pUCm-T-lat,经EcoRⅠ-HindⅢ双酶切后得到lat基因片段,再克隆到pKC1139上,由此得到重组质粒pKC1139-lat。分别以EcoRⅠ-ScaⅠ及HindⅠ-ScaⅠ对pKC1139-lat进行双酶切,去除lat基因片段上的部分片段,再分别自连,得到重组质粒pKCLES、pKCLHS。 通过原生质体转化技术,对棒状链霉菌原生质体形成和再生条件进行了优化。采用PEG1000介导质粒转化棒状链霉菌原生质体,获得同源单交换突变株,得到lat基因阻断的突变菌株。
论文目录:
摘要
Abstract
1 前言
1.1 β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸
1.1.1 克拉维酸产生菌
1.1.2 克拉维酸抑酶机制
1.1.3 克拉维酸的检测
1.1.3.1 高效液相色谱法
1.1.3.2 紫外分光光度法
1.1.3.3 生物检测法
1.2 提高棒状链霉菌克拉维酸产量的途径
1.2.1 与克拉维酸有关的棒状链霉菌的分子生物学研究进展
1.2.1.1 克拉维酸的生物合成途径
1.2.1.2 克拉维酸的基因调控
1.2.2 提高克拉维酸产量的遗传学策略
1.2.2.1 经典遗传学技术提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究
1.2.2.2 基因工程的方法提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究
1.3 链霉菌的基因转移系统
1.3.1 链霉菌原生质体的转化
1.3.2 转化的影响因素
1.3.3 转化的研究进展
1.4 本课题研究目的和研究内容
1.4.1 研究的目的和意义
1.4.2 研究的主要内容
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌种及质粒
2.1.2 试剂
2.1.3 工具酶及标准蛋白
2.1.4 抗生素
2.1.5 主要仪器
2.1.6 培养基及溶液
2.1.6.1 培养基
2.1.6.2 溶液
2.2 实验方法
2.2.1 菌体培养条件
2.2.2 克拉维酸的分析方法
2.2.2.1 高效液相色谱检测法
2.2.2.2 紫外分光光度检测法
2.2.2.3 生物检测法
2.2.3 大肠杆菌中质粒DNA的小量制备
2.2.4 棒状链霉菌染色体DNA的提取
2.2.5 PCR扩增目的基因
2.2.5.1 PCR引物的设计
2.2.5.2 PCR扩增lat基因
2.2.6 DNA片段的体外重组
2.2.6.1 重组质粒pUCm-T-lat的构建
2.2.6.2 重组质粒pKC1139-lat的构建
2.2.6.3 lat基因互补缺失的重组质粒pKCLHS、pKCLES的构建
2.2.7 质粒DNA对大肠杆菌的转化
2.2.7.1 氯化钙转化法
2.2.7.2 电击转化
2.2.8 琼脂糖凝胶电泳
2.2.9 棒状链霉菌孢子悬浮液的制备
2.2.10 活菌计数测定孢子悬浮液浓度
2.2.11 棒状链霉菌原生质体的制备
2.2.12 棒状链霉菌原生质体再生率的测定
2.2.13 质粒转化棒状链霉菌原生质体
2.2.13.1 快速小量转化法
2.2.13.2 标准转化法
2.2.14 棒状链霉菌质粒的小量提取
2.2.15 棒状链霉菌质粒的大量提取
3 结果与讨论
3.1 棒状链霉菌生理及生物学特性
3.1.1 棒状链霉菌的生理特性
3.1.2 克拉维酸的生物活性
3.1.2.1 棒状链霉菌的发酵培养
3.1.2.2 克拉维酸的体外抑菌活性
3.2 克拉维酸分析方法的确定
3.2.1 高效液相检测法
3.2.2 紫外分光光度法
3.2.3 生物检测法
3.2.4 三种分析测定方法的比较
3.3 重组质粒pKCLHS、pKCLES的构建
3.3.1 重组质粒pKCLES、pKCLHS构建流程
3.3.2 棒状链霉菌lat基因的扩增
3.3.2.1 棒状链霉菌染色体DNA的提取
3.3.2.2 PCR扩增lat基因
3.3.3 重组质粒pUCm-T-lat的构建
3.3.3.1 目的基因与pUCm-T载体的连接
3.3.3.2 重组质粒pUCm-T-lat转化大肠杆菌及阳性转化子的鉴定
3.3.4 重组质粒pKC1139-lat的构建
3.3.4.1 目的基因与pKC1139载体的连接
3.3.4.2 重组质粒pKC1139-lat转化大肠杆菌及阳性转化子的鉴定
3.3.5 lat基因互补缺失重组质粒pKCLHS、pKCLES的构建
3.3.5.1 重组质粒pKCLHS、pKCLES的体外构建
3.3.5.2 重组质粒pKCLHS、pKCLES转化大肠杆菌及阳性转化子的鉴定
3.4 质粒转化棒状链霉菌原生质体的研究
3.4.1 棒状链霉菌菌丝体培养条件的优化
3.4.1.1 蔗糖浓度的确定
3.4.1.2 碳源的确定
3.4.1.3 pH值的确定
3.4.1.4 甘氨酸浓度的确定
3.4.2 棒状链霉菌原生质体制备条件的优化
3.4.2.1 棒状链霉菌生长曲线的绘制
3.4.2.2 溶菌酶用量及酶解时间的确定
3.4.3 棒状链霉菌原生质体再生条件的优化
3.4.3.1 再生培养基的确定
3.4.3.2 再生培养基干燥程度的影响
3.4.3.3 涂布方法的选择
3.4.3.4 再生率的确定
3.4.4 棒状链霉菌原生质体转化条件的研究
3.4.4.1 原生质体和质粒DNA的浓度
3.4.4.2 阿泊拉霉素的选择时间
3.4.4.3 抗生素的选择浓度
3.4.4.4 对原生质体进行热处理
3.4.4.5 聚乙二醇的类型及浓度的选择
3.4.5 棒状链霉菌lat基因阻断菌株的获得
4 结论
5 展望
6 致谢
7 参考文献
8 附录
9 论文发表情况
发布时间: 2007-01-10
参考文献
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