发菜（Nostoc flagelliforme）不同生长状态差异蛋白质组学研究

论文摘要

发菜是一种陆生固氮蓝藻,主要分布于干旱―半干旱荒漠草原地区,是当地主要的生物固氮资源和拓荒植物。本研究建立了发菜蛋白质组学研究技术,研究了日生长周期中不同生长状态下的蛋白质表达差异、干燥失水和恢复吸水状态下的超微结构、生理学和蛋白质表达差异,克隆了与生长发育和抗逆相关的差异蛋白（Peroxiredoxin、Mn-CAT、Ferritin和Hypothetical protein NXL-01）基因,进行了生物信息学分析,研究其原核表达,并进行了RT-PCR和Western blot验证。1发菜蛋白质组学研究方法的建立为建立适用于发菜蛋白质组研究的双向电泳技术,对发菜蛋白质的提取、裂解、上样量、IEF及SDS-PAGE电泳等关键步骤进行了优化,结果显示:发菜蛋白质主要分布在pH4～7范围内,采用改良TCA法可提高提取液中蛋白质的含量和双向电泳图谱的分辨率,裂解液含60 mmol/L DTT,上样量1.3 mg /（24 cm IPG胶条）时不仅提高了蛋白质的溶解性,而且改善了双向电泳的分离效果,蛋白点清晰,图谱分辨率较好。采用优化后的双向电泳体系提高了发菜蛋白质双向电泳的分辨率和重复性,建立起一套适用于发菜蛋白质组分析的双向电泳方法。利用双向凝胶电泳（2-DE）技术,PDQuest软件分析图像,基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF/MS）分析得到肽质量指纹图谱（PMF）,通过MASCOT和NCBI进行数据库检索,初步建立了发菜蛋白质组学研究方法。从2-DE图谱中选择89个蛋白点进行蛋白质谱鉴定,共成功鉴定到68个蛋白点,代表44种蛋白,鉴定率为76.40%。57个蛋白点确定为数据库中收录的蓝藻的蛋白,其中43个来源于已知的点形念珠藻的蛋白,7个来源于念珠藻PCC 7120,2个来源于鱼腥藻,3个来源于普通念珠藻,4个未鉴定出物种来源。另有3个蛋白点来源于其他物种。对发菜SOD的PMF和氨基酸序列进行了分析,表明与普通念珠藻SOD的序列覆盖率为41%。2发菜日生长周期差异蛋白质组学研究在生长季节的日生长周期中,早晨发菜凈光合速率与暗呼吸速率旺盛，固氮酶和谷氨?泛?成酶活性高,氮代谢活跃;中午随着气温升高,发菜失水干燥,光照强度加大,凈光合速率与暗呼吸速率均急剧下降,固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性降低;下午,气温逐渐下降,光照强度逐渐减弱,发菜再次逐渐吸收少量空气中的水分,凈光合速率与暗呼吸速率均小幅回升，固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性回升。运用2-DE对生长季节的日生长周期中不同生长状态发菜差异蛋白分离进行分离,在上午7:00的2-DE图谱上共检测到蛋白点1247个,下午13:00的2-DE图谱上共检测到蛋白点1164个,下午19:00的2-DE图谱上共检测到蛋白点1188个。3个时期2-DE图谱的平均匹配率为71.32 %。对3个时期2-DE图谱Master胶进行统计,匹配的蛋白点较多集中在66.2-26.6kD,占总蛋白点数的68%,pH 4.5～6之间,占总蛋白点数的83%。PDQuest图像软件分析表明,有38个表达量差异在2倍以上蛋白点,其中18个差异蛋白呈下调表达,7个蛋白呈上调表达,13个蛋白先下调然后上调表达。MALDI-TOF-TOF/MS鉴定结果表明,有31个蛋白点被成功鉴定（鉴定率为81.58%）,可以分为6个功能类群,包括分泌和调节蛋白（15.79%）,抗氧化作用相关的蛋白（20.05%）,氮代谢相关的蛋白（10.53%）,能量和糖代谢相关的酶（10.53%）,细胞分裂相关蛋白（2.63%）,未知蛋白（21.05%）等,另有7个蛋白点未鉴定成功（18.42%）。这些差异蛋白在发菜的生长发育和抗逆作用有中具有重要功能。3干燥和恢复吸水发菜超微结构、生理和蛋白质组学分析在发菜持续失水48 h,然后恢复吸水4 h条件下,形态和结构分析表明,持续失水48h（48HAD）的发菜外表干燥、邹缩,呈黑色,但藻体、藻丝体、胶鞘和细胞结构完整,类囊体膜及细胞内颗粒物质无明显变化,恢复吸水4 h后,藻体膨胀、呈蓝绿色或棕褐色,具有光泽,藻体、藻丝体、胶鞘和细胞结构完整,但细胞内液泡的数量和体积比干燥发菜细胞的要多;生理学分析表明,恢复吸水4 h后的发菜自由水含量、自由水/束缚水比值、净光合活性、暗呼吸速率、RuBisCO活性、可溶性糖、ō2˙、SOD、CAT、POD、固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性显著增加,而MDA、H2O2、氨、脯氨酸、谷氨酸盐含量明显下降;比较蛋白质组学研究表明,与失水—复吸水密切相关的32个蛋白被鉴定,包括分泌蛋白（2.38%）、信号转导（2.38%）、转录和翻译（4.76%）、抗氧化过程（11.90%）、氮代谢（9.52%）、碳和能量代谢（11.90%）、脂代谢（2.38%）、分子伴侣（4.76%）、未知蛋白（28.57%）和没有鉴定成功蛋白（21.43%）。基于形态结构、生理和蛋白质组学分析,表明随着干燥失水和恢复吸水,发菜的生长发育呈现静止休眠与复苏生长交替进行,在干燥条件下,生理代谢减弱,生长缓慢甚至停止,而当恢复吸水,代谢水平上调,生理活性增强,生长启动甚至加速。形态结构、生理和蛋白质组分的变化体现了发菜对特殊生态环境的适应。4发菜生长与耐旱相关差异蛋白基因克隆与原核表达通过分析发菜过氧化物氧还蛋白（Peroxiredoxin）、锰过氧化氢酶（Mn-CAT）、铁氧还蛋白（Ferritin）和Hypothetical protein NXL-01在不同生长状态及持续干燥48 h和复吸水4 h后的差异表达水平,根据鉴定的已知氨基酸序列设计简并性引物克隆基因并进行生物信息学分析,研究克隆基因的原核表达和分子验证。结果表明:（1）根据简并性引物克隆获得长度为639 bp的过氧化物氧还蛋白基因,GenBank登陆号为BankIt1373957（HM854286）;693 bp的锰过氧化氢酶基因,GenBank登陆号为BankIt1311043（GU549477）;540 bp的铁氧还蛋白基因,GenBank登陆号为BankIt1373981（HM854287）;327 bp的Hypothetical protein NXL-01基因,GenBank登陆号为BankIt1374705（HM854288）。（2）生物信息学分析表明:①过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和Hypothetical protein NXL-01序列比较分析显示该基因具有较高的保守性。②过氧化物氧还蛋白在第194的Pro亲水性最强,第122位的Arg疏水性最强;锰过氧化氢酶在第206的Gly亲水性最强,第96位的Val疏水性最强;铁氧还蛋白在第128的Asp和129位的Glu亲水性最强,第28位的Tyr疏水性最强;Hypothetical protein NXL-01在第101位的Glu亲水性最强,第12位的Gly疏水性最强。③过氧化物氧还蛋白二级结构主要由α螺旋、β折叠和随机卷曲构成;锰过氧化氢酶二级结构主要由α螺旋、β折叠和随机卷曲构成;铁氧还蛋白二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成;Hypothetical protein NXL-01二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成。④蛋白跨膜区分析表明过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和Hypothetical protein NXL-01为膜外蛋白。⑤过氧化物氧还蛋白的Ser有5个磷酸化位点,Thr有6个磷酸化位点,Tyr有2个磷酸化位点;锰过氧化氢酶的Ser有3个磷酸化位点,Thr有1个磷酸化位点,Tyr有2个磷酸化位点;铁氧还蛋白的Ser有1个磷酸化位点,Thr有2个磷酸化位点,Tyr有1个磷酸化位点;Hypothetical protein NXL-01的Ser有5个磷酸化位点,Thr有1个磷酸化位点。（3）将过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和Hypothetical protein NXL-01基因在大肠杆菌中表达,分别获得一个约26.5 kD、26 kD、22.4 kD和12.4 kD的外源蛋白。（4）对过氧化物氧还蛋白和锰过氧化氢酶基因在大肠杆菌中表达的蛋白进行Western blotting验证,表明外源蛋白为过氧化物氧还蛋白和锰过氧化氢酶。（5）RT-PCR分析表明,在日生长周期的不同状态下,锰过氧化氢酶基因、过氧化物氧还蛋白基因和铁氧还蛋白基因在转录和翻译水平上具有同样表达差异,而Hypothetical protein NXL-01基因在转录水平上无明显差异;在干燥和复吸水状态下,过氧化物氧还蛋白基因、锰过氧化氢酶基因、铁氧还蛋白基因和Hypothetical protein NXL-01在转录和翻译水平上具有同样表达差异。研究结果为进一步研究发菜生长发育和耐旱的分子机理及探讨发菜对极端干旱环境的适应和保护机制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 前言
• 1 发菜研究进展
• 1.1 发菜形态结构与生长繁殖方式
• 1.2 发菜生境特点
• 1.3 发菜的生理生化特性
• 1.3.1 水分生理
• 1.3.2 光合生理
• 1.3.3 固氮生理
• 1.3.4 发菜抗性生理
• 1.4 发菜的人工培养研究进展
• 1.4.1 培养方式、培养基、营养条件与发菜的人工培养
• 1.4.2 环境因子与发菜人工培养
• 1.4.3 植物生长物质与发菜人工培养
• 1.5 发菜分子生物学方面的初步研究
• 1.6 发菜相关蛋白的研究
• 2 蓝藻蛋白质组学研究进展
• 2.1 蛋白质组学研究策略
• 2.2 蛋白质组学研究技术
• 2.2.1 双向凝胶电泳技术
• 2.2.2 质谱鉴定技术
• 2.2.3 生物信息学技术
• 2.3 蓝藻蛋白质组学研究进展
• 2.3.1 蓝藻高通量蛋白质组学研究
• 2.3.2 几种模式蓝藻差异蛋白质组学研究
• 2.4 蓝藻蛋白质组学研究存在的问题及展望
• 3 本论文的研究内容及目的意义
• 第二章 基于双向电泳和串联质谱技术的发菜蛋白质组研究方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要生化试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 溶液配制
• 1.2.2 发菜总蛋白质样品的提取
• 1.2.3 蛋白质定量
• 1.2.4 双向电泳
• 1.2.5 凝胶染色及图像分析
• 1.2.6 质谱样品的制备
• 1.2.7 质谱分析
• 1.2.8 数据库查询及蛋白质鉴定
• 1.3 数据处理
• 2 结果和分析
• 2.1 蛋白质提取方法的优化
• 2.2 第一向 IEF 等电聚焦pH 范围的选择
• 2.3 裂解液中 DTT 浓度对蛋白质双向电泳分辩率的影响
• 2.4 上样量对蛋白质双向电泳分辩率的影响
• 2.5 发菜2-DE 分离的重复性及其效果
• 2.6 发菜蛋白质2-DE 分析
• 2.7 发菜蛋白的MALDI-TOF-TOF/MS 分析和数据库检索鉴定
• 2.8 发菜SOD 的MALDI-TOF-TOF /MS 肽质量指纹图谱分析及数据库分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 发菜日生长周期差异蛋白质组学研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要生化试剂和仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 光合活性的检测
• 1.3.2 固氮酶活性的检测
• 1.3.3 谷氨酰胺合成酶（GS）检测
• 1.3.4 蛋白质提取
• 1.3.5 双向电泳
• 1.3.6 凝胶染色及图像分析
• 1.3.7 质谱样品的制备
• 1.3.8 质谱分析方法
• 1.3.9 数据库查询及蛋白质鉴定
• 1.4 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 发菜日生长周期光合作用的变化
• 2.2 发菜日生长周期固氮酶活性和固氨酰胺合成酶活性的变化
• 2.3 发菜日生长周期不同生长状态蛋白质的2-DE 分析
• 2.4 发菜差异表达蛋白的鉴定及功能分类
• 3 讨论
• 3.1 参与分泌和调节作用的相关蛋白
• 3.2 参与抗氧化作用的相关蛋白
• 3.3 参与氮代谢相关的蛋白
• 3.4 参与能量和糖代谢相关的蛋白
• 4 小结
• 第四章 干燥和恢复吸水发菜超微结构、生理和蛋白质组学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要生化试剂和仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 透射电镜（TEM）样品制备及观察
• 1.3.2 自由水与束缚水的检测
• 1.3.3 光合作用与呼吸作用的检测
• 1.3.4 RuBisco 总活性的测定
• 1.3.5 丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量的测定
• 1.3.6 超氧阴离子自由基和过氧化氢水平的检测
• 1.3.7 抗氧化酶活性的测定
• 1.3.8 固氮酶活性和谷氨酰胺合成酶活性检测
• 1.3.9 氨含量和谷氨酸盐含量的测定
• 1.3.10 蛋白质提取
• 1.3.11 双向电泳（2-DE）
• 1.3.12 凝胶染色及图像分析
• 1.3.13 质谱样品的制备
• 1.3.14 MALDI-TOF-TOF /MS 质谱分析方法
• 1.3.15 数据库查询及蛋白质鉴定
• 1.3.16 Western blot
• 1.4 统计学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 发菜干燥失水和恢复吸水后形态和超微结构差异
• 2.2 自由水（FW）含量和自由水/束缚水（FW/BW）的变化
• 2.3 净光合速率、呼吸速率和RuBisco 总活性的变化
• 2.4 丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量的变化
• 2.5 氨含量、谷氨酸盐含量、固氮酶活性和谷氨酰胺合成酶活性的变化
• 2.6 ROS 水平和抗氧化酶活性的变化
• 2.7 蛋白质组表达差异
• 2.8 差异蛋白鉴定及功能分类
• 2.9 免疫学分析
• 3 讨论
• 3.1 发菜是一种适应“干燥—吸水”水分节律的复苏植物
• 3.2 干燥与恢复吸水对发菜能量代谢的影响
• 3.3 干燥和复吸水条件下发菜氮代谢变化
• 3.4 干燥和复吸水条件下发菜清除和调节ROS 机制
• 4 小结
• 第五章 发菜生长与耐旱相关差异蛋白基因克隆与原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 生化试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 发菜基因组DNA 提取
• 1.2.2 基因组DNA 纯度、浓度和完整性检测
• 1.2.3 目的基因的PCR 扩增
• 1.2.4 PCR 产物的回收
• 1.2.5 目的基因与载体连接
• 2 法制备感受态细胞DH5α'>1.2.6 CaCl₂法制备感受态细胞DH5α
• 1.2.7 转化DH5α感受态细胞及目的片段测序
• 1.2.8 生物信息学分析
• 1.2.9 克隆基因原核表达
• 1.2.10 发菜日生长周期及干燥（48HAD）和恢复吸水（4HAR）条件下Peroxiredoxins、Mn-CAT、Ferritin 和 Hypothetical protein NXL-01 基因的RT-PCR
• 1.2.11 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 发菜过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 差异表达及质谱分析
• 2.1.1 发菜过氧化物氧还蛋白MALDI-TOF-TOF/MS 肽质量指纹图谱分析
• 2.1.2 发菜锰过氧化氢酶MALDI-TOF-TOF/MS 肽质量指纹图谱分析
• 2.1.3 发菜铁氧还蛋白 MALDI-TOF-TOF/MS 肽质量指纹图谱分析
• 2.1.4 发菜Hypothetical protein NXL-01 的MALDI-TOF-TOF-MS/MS 肽质量指纹图谱分析
• 2.2 发菜基因组DNA 的提取
• 2.3 发菜过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 基因的PCR 扩增
• 2.3.1 发菜过氧化物氧还蛋白基因的PCR 扩增
• 2.3.2 发菜锰过氧化氢酶基因的PCR 扩增
• 2.3.3 发菜铁氧还蛋白基因的PCR 扩增
• 2.3.4 发菜Hypothetical protein NXL-01 基因的PCR 扩增
• 2.4 目的片段的克隆
• 2.4.1 过氧化物氧还蛋白基因目的片段的克隆
• 2.4.2 锰过氧化氢酶基因目的片段的克隆
• 2.4.3 铁氧还蛋白基因目的片段的克隆
• 2.4.4 Hypothetical protein NXL-01 目的片段的克隆
• 2.5 发菜过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 生物信息学分析
• 2.5.1 过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 基因序列测定及同源分析
• 2.5.2 发菜过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 疏水性分析
• 2.5.3 发菜过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 二级结构预测
• 2.5.4 发菜过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 跨膜区分析
• 2.5.5 发菜过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 磷酸化位点分析
• 2.6 过氧化物氧还蛋白、锰过氧化氢酶、铁氧还蛋白和 Hypothetical protein NXL-01 在E.coli 中的表达
• 2.6.1 过氧化物氧还蛋白在E.coli 中的表达
• 2.6.2 锰过氧化氢酶在E.coli 中的表达
• 2.6.3 铁氧还蛋白在E.coli 中的表达
• 2.6.4 Hypothetical protein NXL-01 在E.coli 中的表达
• 2.7 锰过氧化氢酶和过氧化物氧还蛋白Western blotting 鉴定
• 2.8 发菜日生长周期及干燥（48HAD）和恢复吸水（4HAR）条件下Peroxiredoxins、Mn-CAT、Ferritin 和 Hypothetical protein NXL-01 基因的RT-PCR 分析
• 2.8.1 发菜总RNA 的提取
• 2.8.2 发菜日生长周期中Peroxiredoxins、Mn-CAT、Ferritin 和 Hypothetical protein NXL-01 基因的表达特征
• 2.8.3 发菜干燥（48HAD）和恢复吸水（4HAR）条件下Peroxiredoxins、Mn-CAT、Ferritin 和 Hypothetical protein NXL-01 基因的表达特征
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 本论文的创新点
• 参考文献
• 附录
• 在读博士期间发表的相关论文
• 致谢