血浆Exosomes小体对Treg细胞功能的影响及B细胞体外扩增Treg细胞的初步研究

论文摘要

1.通过将人血浆Exosomes小体、重组Wnt分子分别与人外周血CD4+CD25+CD1271ow调节性T细胞（Regulatory T Cells, Treg）作用,观察Treg细胞在体外的存活情况及其Wnt信号通路的变化。2.通过将同种异基因人外周血B淋巴细胞体外扩增Treg细胞,观察Treg细胞扩增前后在数量上的变化及表型和功能是否改变,建立体外扩增Treg细胞的有效方法,并与树突细胞（dendritic cell, DC）扩增Treg细胞的方法相比较。1.应用免疫磁珠分离方法分离纯化人外周血CD4+CD25+CD1271owTreg细胞,将Wnt分子和从多个健康供者血浆中分离得到的Exosomes小体分别加入到Treg细胞中,加入人白介素2（IL-2,50U/ml）。利用RT-PCR检测共培养12h后Wnt信号通路涉及的凋亡相关基因的改变,同时采用流式技术检测Wnt信号通路中磷酸化β-catenin水平的改变,并在共培养14天后采用流式技术检测各组细胞的凋亡情况。设立未经处理的Treg细胞组为对照组。2.将异体健康供者外周血分离得到的B淋巴细胞与磁珠分选得到的Treg细胞共孵育,用IL-2（IOOU/ml）和CD28单抗（500ng/ml）共同刺激,在培养14天的过程中通过流式检测Treg细胞表型的变化,同时与树突状细胞扩增Treg细胞的方法相比较（培养条件相同）。14天培养结束后,将细胞与CFSE处理过的经强刺激（加入CD3单抗500ng/ml,IL-2300U/ml）的CD4+效应性T细胞共培养,在第五天通过流式检测Treg细胞对CD4+T细胞的增殖抑制,设立只经强刺激的CFSE处理过的CD4+T细胞为对照组。1.通过RT-PCR分析纯化的Treg细胞上的Frizzled（FRZ）受体及低密度脂蛋白相关蛋白5（LRP5）和LRP6的基因表达,结果显示Treg细胞表达FRZ2、3、4,LRP6基因,通过Western Blotting技术检测血浆中Exosomes小体上Wnt3a和Wnt5a的蛋白表达,均有条带出现。共培养12h后,RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-xL、Bcl-2、c-Myc的表达,结果显示Treg细胞与血浆exosomes样小体或Wnt分子共培养时,抗凋亡基因Bcl-2相对于对照组均有明显的上调,另一抗凋亡基因Bcl-xL和诱导凋亡的基因c-Myc无明显变化。培养14天后,通过流式检测凋亡,加入Exosomes样小体或Wnt分子的Treg细胞生存率均比对照组高。2.经B细胞联合IL-2和CD28单抗刺激的Treg细胞在培养14天后流式检测Foxp3和CD4/CD25,阳性率均很高,此时计数Treg细胞为最初数量的20倍。利用CFSE检测技术,将扩增14天的Treg细胞与CD3单抗和IL-2强刺激的CD4+T细胞共培养,5天后流式检测,扩增后的Treg细胞能够有效地抑制CD4+T细胞的增殖功能。1.初步判断Wnt信号通路能够影响Treg细胞的生存状态,血浆Exosomes小体能够延长Treg细胞的生存时间,其中Exosomes小体携带Wnt分子与Treg细胞上的Frizzled受体作用可以活化Treg细胞的Wnt信号通路,在提高Treg细胞的生存率方面起了一定的作用,即血浆Exosomes小体可能通过Wnt信号通路途径影响Treg细胞的存活。2.同种异基因B淋巴细胞能够在体外有效的扩增人外周血Treg细胞,扩增效率可达20倍以上,并且能显著抑制CD4+T细胞的增殖。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章:人血浆中Exosomes小体通过Wnt信号通路对CD4+CD25+CD127low调节性T细胞生物特性的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果与分析
• 讨论
• 参考文献
• 第二章:人外周血B淋巴细胞体外扩增CD4+CD25+CD127low调节性T细胞的初步研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果与分析
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 致谢