EWS-FLI1融合区与HLA-A*0201限制性CTL表位的实验研究

论文摘要

目的:预测、筛选及合成尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2.1限制性细胞毒性T细胞表位,并进行初步鉴定。方法:（1）表位预测、分子动力学模拟、表位肽的合成:运用BIMAS、SYFPEITHI、Predep和Immune Epitope Database and Analysis Resource （IEDB）软件预测EWS-FLI1可能的HLA-A2.1限制性CTL表位。应用多项式方案、量化基序方案对预测的CTL表位进行筛选,并将筛选的表位与HLA-A2.1分子进行动力学模拟。根据预测、筛选的结果,按标准Fmoc方案合成抗原多肽,并纯化、鉴定。（2）表位肽刺激的CTL产生颗粒溶素的检测:分离收集健康人外周血PBMC,鉴定HLA-A2.1阳性表达,进行DC诱导,制备尤文肉瘤冻融抗原冲击致敏的DC（TP-DC）。制备效应细胞。采用ELISA定量测定抗原肽刺激的效应细胞所产生颗粒溶素（Granulysin）的能力。（3）效应细胞对靶细胞的杀伤作用的检测:以尤文肉瘤A673为靶细胞,按不同的效靶比将效应细胞与A673共育,乳酸脱氢酶ELISA检测杀伤率。结果:1.结合BIMAS、SYFPEITHI、Predep和IEDB预测EWS-FLI1可能的HLA-A2.1限制性CTL表位,共8个。经多项式方案、量化基序方案进一步筛选,确定其中4个肽为候选表位肽。2.应用分子动力学模拟,初步验证了4个候选表位肽与HLA-A2.1分子的结合力。色谱测定各候选肽的纯度均在以98%以上,质谱分析各肽的分子量与理论值相符。3.颗粒溶素释放实验证实筛选的4条表位肽均能产生刺激效应,其中表位肽QIQLWQFLL（EWS-FLI1 304）的刺激效应最为显著。4.靶细胞杀伤实验证实筛选的表位肽均能产生杀伤效应, QIQLWQFLL（EWS-FLI1 304）尤文肉瘤细胞具有较强的杀伤作用,且随效靶比升高,杀伤率递增。结论:1.综合运用多个方案可提高预测效率,分子动力学模拟可初步验证表位肽与HLA-A2.1分子的结合力。2.颗粒溶素释放实验和乳酸脱氢酶实验初步鉴定了QIQLWQFLL是EWS-FLI1蛋白的HLA-A2.1限制性CTL表位。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 第2章 材料与仪器
• 2.1 主要实验试剂
• 2.2 主要实验细胞株
• 2.3 实验仪器
• 第3章 实验方法
• 3.1 EWS-FLI1 蛋白 1HLA-A2.1 限制性 CTL 表位预测、筛选和分子动力学模拟
• 3.1.1 EWS-FLI1 蛋白 HLA-A2.1 限制性 CTL 表位肽的预测、筛选
• 3.1.2 HLA-A2.1 分子与表位多肽的分子动力学模拟
• 3.1.3 结合特征参数计算
• 3.2 表位肽的合成
• 3.3 EWS-FLI1 抗原递呈及制备
• 3.3.1 尤文肉瘤细胞 A673 的培养
• 3.3.2 外周血单个核细胞 HLA-A*0201 的分离及鉴定
• 3.3.2.1 外周血 PBMC 的分离
• 3.3.2.2 HLA-A2.1 阳性 PBMC 的鉴定
• 3.3.3 尤文肉瘤 EWS-FLI1 抗原的制备
• 3.3.4 树突状细胞的制备
• 3.3.5 尤文肉瘤冻融抗原冲击致敏树突状细胞
• 3.4 效应细胞的制备
• 3.5 表位肽刺激的 CTL 颗粒溶素实验
• 3.6 效应细胞对靶细胞的杀伤实验
• 3.7 数据统计分析
• 第4章 实验结果
• 4.1 HLA-A2.1 限制性 CTL 表位的预测和筛选
• 4.2 表位肽与 HLA-A2.1 分子模拟及结合特征参数计算结果
• 4.3 表位肽的合成、RP-HPLC 及 MS 鉴定结果
• 4.4 HLA-A2.1 阳性 DC 的诱导
• 4.5 颗粒溶素（GNLY）酶联免疫吸附实验
• 4.6 效应细胞杀伤靶细胞实验结果
• 第5章 讨论
• 第6章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间发表的论文
• 附带综述