论文摘要
多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是骨髓浆细胞克隆性增殖的血液系统恶性肿瘤,发生率约占血液系统肿瘤的10%,全身恶性肿瘤的1%,是血液系统发病居第二位的常见恶性肿瘤。尽管MM的发病高峰为65至70岁,最近的统计结果显示MM的发病率正在提高,发病年龄出现年轻化趋势。MM特点是骨髓中浆细胞克隆性增殖,分泌M蛋白,同时伴有广泛的溶骨病变和骨质疏松。MM对化疗存在普遍抵抗性,目前还是一种难以治愈的致死性疾病。标准的化疗方案仅能使40-60%病人获得暂时缓解,中位生存期一般不超过3年。大剂量化疗联合造血干细胞移植可使缓解率明显提高。除了极少数病例,最终难免复发。正因为如此,人们对寻找新的抗癌药寄予厚望,以进一步提高MM患者的生存率和治愈率。近年来,随着对MM的发病机制和病理生理的深入研究,治疗MM的新思路、新方法相继出现。新药如免疫调节药物（Thalidomide analogues）和蛋白酶体抑制剂（bortezomib）的问世给MM的治疗带来革命性的改观,正逐步取代干细胞移植后的以蒽环类抗生素、长春新碱和地塞米松为主的常规化疗方案。力达霉素（Lidamycin,LDM）是本研究所从一株放线菌（Streptomycesglobisporus C-1027）代谢产物中获得的对多种肿瘤细胞有强烈杀伤作用的大分子肽类抗肿瘤抗生素,大量研究表明,LDM对多种肿瘤细胞及移植瘤具有极强的抗肿瘤活性,这都源于LDM对DNA的强烈地切割作用。最近研究显示LDM可引起肿瘤细胞染色体畸变及端粒功能异常。目前,LDM正作为一种新的化疗药物进行临床Ⅱ期试验研究。本课题选用一种小鼠骨髓瘤细胞株:SP2/0和2种人多发性骨髓瘤细胞株:U266和SKO-007,探讨LDM体内体外对鼠骨髓瘤和人多发性骨髓瘤的影响及其作用机制。此外本课题还初步研究了LDM联合bortezomib对人多发性骨髓瘤细胞U266和SKO-007的影响,从而为LDM联合bortezomib的临床应用提供基础。1.LDM抗鼠骨髓瘤作用的分子机制研究1.1 LDM作用于小鼠骨髓瘤细胞的体外实验研究1.1.1 MTS结果显示LDM显著抑制鼠骨髓瘤SP2/0细胞的增殖。与其它临床常用化疗药物相比,LDM抑制SP2/0细胞增殖的作用更强,其IC50值远低于其它药物。也检测了不同剂量的LDM作用不同时间对SP2/0细胞的增殖抑制作用,结果显示,LDM抑制SP2/0细胞增殖的作用为浓度和时间依赖性。1.1.2 LDM对鼠骨髓瘤SP2/0细胞形态的影响。LDM作用SP2/0细胞12 h后,细胞形态发生明显改变,光学显微镜下可见典型表现为细胞体积变大,还观察到了胞浆空泡,在0.5 nM的浓度下空泡更明显。1.1.3 Hoechst33342荧光染色法和FITC-AnnexinⅤ/PI双染结合流式细胞仪检测LDM对SP2/0细胞凋亡的诱导作用。结果显示不同浓度的LDM作用细胞48 h后,细胞凋亡率呈浓度依赖性地增高。0.1 nM、0.5 nM、1 nM和2 nM LDM作用于SP2/0的细胞凋亡率分别为14.66%+1.31%、18.30%±2.34%、43.65%±1.12%和79.34%±1.19%,显著高于对照组的4.70%±0.46%。荧光显微镜下可见LDM作用48 h后的细胞出现典型的凋亡细胞形态学变化,染色质凝集、细胞核固缩、形成凋亡小体等多种改变。1.1.4 PI单染结合流式细胞仪检测LDM对SP2/0细胞周期分布的影响。结果显示不同浓度的LDM作用细胞48 h后均能诱导G2/M期阻滞,0.5 nM的LDM诱导的G2/M期阻滞最明显,随着浓度升高（1 nM和2 nM）,凋亡相关的亚G1峰比例显著增加,因此诱导的G2/M期阻滞作用反不如0.5 nM的LDM明显。1.1.5 Western blot法检测了LDM对细胞周期和凋亡相关蛋白的影响。结果显示LDM浓度及时间依赖性诱导SP2/0细胞caspase-3、caspase-7的活化及PARP（polyADP-ribose polymerase）的切割,浓度依赖性的下调凋亡抑制蛋白Bcl-2、Survivin的水平,上调p27蛋白的表达。1.1.6 Western blot法检测了LDM对对丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPKs）信号通路分子的表达影响。结果显示磷酸化的（活化形式）JNK、ERK和p38 MAPK的表达随着LDM浓度升高而增加,MAPKs上游蛋白:K-ras和c-Raf的表达随着LDM浓度增加而下降,磷酸化的MEK的表达浓度依赖性升高。也检测了0.5 nM的LDM作用不同的时间对JNK的表达影响。结果显示磷酸化的JNK的表达随着作用时间的延长而增加。1.1.7分别应用JNK抑制剂（SP600125）、p38抑制剂（SB203580）和MEK抑制剂（U0126）预处理SP2/0细胞2h,再加入LDM（0.001 nM,0.01 nM,0.1 nM,和1 nM）继续作用48h,MTS结果显示单独的3种抑制剂对细胞的增殖抑制作用均不明显,但SP600125或SB203580分别与LDM合用后均降低了LDM对SP2/0的细胞毒作用,提示JNK和p38 MAPK的激活参与了LDM对SP2/0细胞的增殖抑制作用,而U0126与LDM合用后提高了LDM对SP2/0的细胞毒作用,提示ERK的激活有利于SP2/0细胞的生存。1.1.8 SP600125预处理SP2/0细胞2 h,再加入LDM（0.5 nM）继续作用48 h,Westernblot结果显示SP600125可消除LDM引起的JNK的活化,同时也消除了LDM引起的caspase-3和caspase-7的激活及PARP的切割。1.2 LDM作用于小鼠骨髓瘤的体内实验研究1.2.1 LDM作用鼠骨髓瘤细胞SP2/0的体内实验研究1.2.1.1 LDM作用于鼠骨髓瘤细胞SP2/0的体内实验研究（一）利用鼠骨髓瘤细胞SP2/0小鼠体内移植瘤模型,观察LDM对小鼠移植性骨髓瘤的生长抑制作用。1×106 SP2/0细胞右侧腋窝皮下接种,在细胞接种后第1天和第8天给药,LDM按照0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、0.025 mg/kg的剂量,尾静脉注射的方式给药。结果显示LDM对SP2/0细胞移植瘤的生长有显著抑制作用,且呈剂量依赖性,0.1mg/kg、0.05 mg/kg、0.025 mg/kg剂量LDM组的抑瘤率分别为97.3%、86.3%和35.7%,与对照组相比具有显著性差异。接种后第10天LDM 0.1 mg/kg剂量组,有一只死亡。LDM 0.05mg/kg剂量组,动物状况良好。1.2.1.2 LDM作用于鼠骨髓瘤细胞SP2/0的体内实验研究（二）利用鼠骨髓瘤细胞SP2/0小鼠体内移植瘤模型,1×106 SP2/0细胞右侧腋窝皮下接种,在细胞接种后第1天和第8天给药,调整LDM的给药剂量为0.06 mg/kg、0.04mg/kg、0.02 mg/kg,仍是尾静脉注射的方式给药。观察LDM对SP2/0细胞移植瘤的生长抑制作用。结果显示0.06 mg/kg、0.04 mg/kg、0.02 mg/kg的LDM对SP2/0细胞移植瘤的生长有显著抑制作用,且呈剂量依赖性,抑瘤率分别为92.1%、74.6.%和35.9%,与对照组相比具有显著性差异。2.LDM抗人多发性骨髓瘤细胞的作用及其分子机制研究2.1 LDM作用于人多发性骨髓瘤的体外实验研究2.1.1 MTS结果显示LDM显著抑制人MM细胞（U266和SKO-007）的增殖。LDM、VCR、5-FU、DEX、ADM对U266细胞的IC50值分别为（5.751±0.153）×10-11M、（7.083±0.106）×10-7M、（3.246±0.084）×10-7M、（1.778±0.113）×10-4M、（2.514±0.127）×10-8M。与其它临床常用化疗药物相比,LDM抑制U266细胞增殖的作用更强,其IC50值远低于其它药物。在SKO-007细胞中观察到同样的结果。2.1.2 LDM对人MM细胞形态的影响。结果显示LDM作用U266和SKO-007细胞12 h后,细胞形态发生明显改变,光学显微镜下可见典型表现为细胞体积变大,还观察到了胞浆空泡。为了进一步观察细胞体积变大是否也影响了细胞核的大小,采用Wright-Giemsa染色,结果显示在LDM作用下U266和SKO-007的细胞核体积也变大。原因可能是LDM对整个细胞的骨架有影响,确切机制有待于进一步研究。2.1.3 Hoechst33342荧光染色法和FITC-AnnexinⅤ/PI双染结合流式细胞仪检测LDM对U266和SKO-007细胞凋亡的诱导作用。结果显示不同浓度的LDM作用细胞48 h后,细胞凋亡率呈浓度依赖性增高。0.1 nM、0.5 nM、1 nM和2 nM LDM作用于U266的细胞凋亡率分别为14.11%±2.31%、18.52%±3.65%、47.55%±4.56%和83.12%±5.33%,显著高于对照组的5.83%±1.45%。荧光显微镜下可见LDM作用后的细胞出现典型的凋亡细胞形态学变化,染色质凝集、细胞核固缩、形成凋亡小体等多种形态学改变。在SKO-007细胞中观察到同样的结果。2.1.4 PI单染结合流式细胞仪检测LDM对U266和SKO-007细胞周期分布的影响。结果显示不同浓度的LDM作用细胞48 h后均能诱导G2/M期阻滞,0.5 nM的LDM诱导的G2/M期阻滞最明显,随着浓度的增大（1 nM和2 nM）,凋亡相关的亚G1峰比例显著增加,因此诱导的G2/M期阻滞作用反不如0.5 nM的LDM明显。2.1.5利用Transwell实验观察LDM对U266和SKO-007细胞迁移能力的影响。结果显示LDM对这两种细胞的迁移能力均有显著的抑制作用,并呈明显的浓度依赖性。2.1.6 Western blot法测定了LDM对侵袭和转移相关靶点分子的影响。结果显示LDM可浓度依赖性地下调U266和SKO-007细胞与侵袭相关的VEGF、MMP-9的表达。2.1.7应用Western blot法测定了LDM对凋亡相关蛋白及细胞周期蛋白的表达的影响。结果显示LDM可浓度依赖性地诱导两种人多发性骨髓瘤细胞caspase-3、caspase-7的激活及PARP的切割,并显著下调凋亡抑制蛋白Bcl-2及Survivin的水平。同时LDM还可上调p21及p27蛋白的表达。2.1.8应用Western blot法测定了LDM对MAPKs信号通路分子的表达影响。结果显示LDM浓度依赖性地激活U266和SKO-007细胞JNK、ERK和p38 MAPK,MAPKs上游蛋白:K-ras、N-ras和c-Raf的表达因细胞类型不同而不同,在LDM的作用下,U266的K-ras、N-ras和c-Raf的表达浓度依赖性的降低,而SKO-007只有N-ras的表达浓度依赖性的降低,K-ras和c-Ra珀勺表达浓度依赖性的升高,在两个细胞中MEK的激活均为浓度依赖性。2.1.9为研究JNK、ERK和p38 MAPK的激活在LDM增殖抑制中的作用,分别应用SP600125、SB203580和U0126预处理U266细胞2 h,再加入LDM（0.001 nM,0.01 nM,0.1 nM,和1 nM LDM）继续作用48 h,MTS结果显示3种抑制剂单独对细胞的增殖抑制作用均不明显,但SP600125或SB203580分别与LDM合用后均降低了LDM对U266的细胞毒作用,而U0126与LDM合用后提高了LDM对U266的细胞毒作用。在SKO-007细胞观察到同样的结果。2.1.10为了探讨MAPKs的激活在LDM诱导凋亡中的作用,分别用SP600125、SB203580和U0126预处理U266细胞2h,再加入LDM（0.5 nM或1 nM LDM）继续作用48h,FITC-AnnexinⅤ/PI双染结合流式细胞仪检测结果显示单独的3种抑制剂对细胞的凋亡诱导作用均不明显,但SP600125或SB203580分别与LDM合用后均降低了LDM对U266的细胞凋亡诱导作用,而U0126与LDM合用后则提高了LDM对U266的细胞凋亡诱导作用。在SKO-007细胞观察到同样的结果。2.1.11为了探讨JNK、p38 MAPK的激活在LDM诱导凋亡中的作用机制,分别用SP600125和SB203580预处理U266细胞2h,再加入LDM（0.5 nM）继续作用48 h,Western blot检测结果显示单独的两种抑制剂对细胞的凋亡相关蛋白的表达影响不大,但SP600125或SB203580分别与LDM合用后均降低了LDM对PARP和aspase3/7的激活。在SKO-007细胞观察到同样的结果。2.1.12应用Western blot法测定了LDM对NF-κB及IκBα表达的影响。结果显示LDM剂量依赖性地诱导两种人多发性骨髓瘤细胞IκBα的磷酸化,但对总IκBα的表达无影响,在LDM的作用下,U266的NF-κB的表达浓度依赖性的降低,而SKO-007浓度依赖性的升高。2.2 LDM对蛋白酶体活性的影响检测了不同剂量的LDM作用于高纯化的20S蛋白酶体对其胰凝乳蛋白酶样活性的影响,发现我们所用的剂量（0.1 nM、0.5 nM、1 nM和2 nM）LDM对胰凝乳蛋白酶样活性没有明显的影响,不同剂量的LDM作用于MM细胞48 h,提取26S蛋白酶体,定量后检测胰凝乳蛋白酶样活性结果同上。可见LDM发挥强大的凋亡诱导作用,并不是通过对蛋白酶体活性抑制实现的。同时发现大剂量的LDM（100nM、1000 nM和10,000 nM）具有激活胰凝乳蛋白酶样活性的作用。3.LDM联合bortezomib作用于人多发性骨髓瘤的的体外实验研究3.1 LDM联合bortezomib抗多发性骨髓瘤的协同作用3.1.1 MTS结果显示,两药联合作用时,能够明显抑制细胞增殖,其CDI＜1,具有协同抗肿瘤作用。3.1.2 FITC-AnnexinⅤ/PI双染结合流式细胞仪检测结果显示联合用药可明显增强单药的凋亡诱导率。低联合浓度（0.5 nM的LDM与5 nM的bortezomib）对U266细胞的凋亡诱导率为22.91%,明显高于两药单用诱导的凋亡率15.07%及3.90%,较高联合浓度（0.5 nM的LDM与10 nM的bortezomib）对U266细胞的凋亡诱导率为67.11%,明显高于两药单用诱导的凋亡率15.07%及5.91%,在SKO-007细胞观察到同样的结果。3.2 LDM联合bortezomib协同抗多发性骨髓瘤的作用机制3.2.1 Western blot结果显示LDM联合bortezomib后可使PARP和caspase-3的切割显著增强,进一步上调了p21的表达。联合用药还降低NF-κB的水平。3.2.2 Western blot法测定了单药及联合用药对MAPKs的表达影响,结果显示,bortezomib呈剂量依赖性地激活JNK和p38 MAPK。两药联合后可使JNK和p38MAPK的激活显著增强。相反,两药联合后可使ERK的激活显著降低。综上,研究表明LDM能够显著抑制体外培养的鼠骨髓瘤和人多发性骨髓瘤的细胞的增殖,比其他常规化疗药细胞毒作用更大。并通过激活JNK和p38 MAPK诱导细胞凋亡,降低肿瘤细胞VEGF和MMP-9的蛋白水平限制细胞迁移。Bortezomib联合LDM显示,bortezomib能够加强LDM的细胞毒作用和凋亡诱导作用。而且,LDM具有显著的体内抗鼠骨髓瘤的作用。
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