论文摘要
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤,恶性度高,尤其肺腺癌转移发生早,对放化疗不敏感,预后差。研究发现低氧与肺癌的生存、转移、不良预后明显相关。肿瘤为适应低氧发生一系列生物学改变,低氧诱导因子-1α（hypoxia-induciblefactor 1α,HIF-1α）是促进这一系列改变的关键调控因子。肿瘤细胞通过高表达HIF-1α对其下游基因进行调控以适应低氧环境,促进生长转移。近期研究表明环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）和上皮钙粘蛋白（Epithelialcadherin,E-cadherin）在恶性肿瘤的异常表达可能与肿瘤细胞适应低氧有关。COX-2及其代谢产物前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）与肺腺癌的发生发展密切相关,研究发现常氧条件下PGE2对肺腺癌细胞HIF-1α具有诱导作用。E-cadherin是保持上皮细胞之间的粘附性维持正常组织结构的关键,其失活机制的研究较多,近期低氧与其的内在联系研究成为热点。本研究从肺腺癌适应低氧的机制角度出发,拟分三部分探讨低氧条件下的肺腺癌细胞是否存在HIF-1α与COX-2/PGE2、E-cadherin内在关联及相互调节机制,为肺癌的靶向治疗提供理论依据。一、HIF-1α、COX-2和E-cadherin在肺腺癌的表达及临床意义目的探讨HIF-1α、COX-2和E-cadherin三项指标在肺腺癌组织中表达的临床意义及其内在联系。方法采用二步法免疫组化检测HIF-1α、COX-2和E-cadherin在45例肺腺癌手术切除标本和10例正常肺组织中的表达,并进行统计分析。结果10例正常肺组织HIF-1α和COX-2表达均为阴性,E-cadherin表达均为阳性。三项指标在肺腺癌中均较正常组织表达异常。其中HIF-1α与COX-2为高表达,E-cadherin为表达下降,其阳性表达率为60%、40%和48.9%。HIF-1α的表达与肺腺癌的分化、分期、淋巴结转移状态无关（x2=2.92,P＞0.05）;（x2=3.4,P＞0.05）;（x2=1.2,P＞0.05）。与肿瘤大小有关（x2=4.85,P＜0.05）,肿瘤直径＞2cm组HIF-1α明显高于＜=2cm组。COX-2的表达在肺腺癌淋巴结转移阳性组明显高于阴性组（x2=10.0,P＜0.05）,且与临床分期有关（x2=9.34,P＜0.05）,Ⅱ期和Ⅲ期组表达明显高于Ⅰ期组。COX-2表达与肿瘤大小有关（x2=6.84,P＜0.05）,肿瘤直径＞2cm组明显高于＜=2cm组。COX-2的表达与分化程度无关（x2=0.16,P＞0.05）。E-cadherin的蛋白表达随着肺腺癌分化程度的降低下降（x2=7.15,P＜0.05）,淋巴结转移转移阳性组表达明显减低（P＜0.05）,与临床分期无关（x2=2.45,P＞0.05）。E-cadherin蛋白表达与肿瘤大小无关（x2=2.07,P＞0.05）。肺腺癌COX-2蛋白表达与HIF-1α高表达有关（x2=3.95,P＜0.05）,而E-cadherin的蛋白表达与HIF-1α表达无关（x2=0.24,P＞0.05）。结论HIF-1、COX-2和E-cadherin的表达与肺腺癌的生存、侵袭、转移有关,HIF-1α在肺腺癌的发生发展中起关键作用,HIF-1α与COX-2之间存在内在关联,低氧可能通过激活HIF-1α诱导COX-2表达使肺腺癌细胞适应低氧,促进生存转移。二、低氧诱导对人肺腺癌细胞A549 HIF-1α、COX-2和E-cadherin表达的影响目的探讨低氧诱导和HIF-1α抑制剂YC-1对人肺腺癌细胞系A549HIF-1α、COX-2和E-cadherin表达的影响,揭示HIF-1α与COX-2、E-cadherin的内在联系。方法首先采用低氧培养箱（5%CO2、1%O2、94%N2、37℃）对人肺腺癌细胞系A549进行低氧诱导,Western blot检测HIF-1α的蛋白表达,实时定量RT-PCR检测COX-2和E-cadherin mRNA的表达。在确定低氧诱导对三项指标的影响后,加用HIF-1α抑制剂YC-1后进行低氧诱导16小时,检测HIF-1α蛋白、COX-2和E-cadherin mRNA表达的变化。结果常氧条件下未见HIF-1α蛋白的表达,低氧条件下可见HIF-1α的表达,低氧8小时、16小时、24小时HIF-1α蛋白表达分别为0.67±0.04、1.45±0.09、0.77±0.09,组间具有显著差异（F=243.9,P＜0.01）,在低氧16小时达到最大值,与低氧8小时组、低氧24小时组之间差别具有统计学意义（P＜0.01）。HIF-1α抑制剂YC-1能明显抑制低氧对HIF-1α的诱导,加用浓度为10μM、100μM YC-1,HIF-1α蛋白表达分别为0.51±0.06、0.06±0.03,与单纯低氧16小时HIF-1α蛋白表达比较具有显著性差异（F=441.1,P＜0.01）。加用YC-1后HIF-1α蛋白表达呈浓度依赖性下降。常氧组、低氧8小时组、16小时组、24小时组COX-2 mRNA表达量分别为7.7±1.5%、25.3±7.7%、65.3±12%、55.0±14.3%,4组间具有显著统计学差异（F=28.9,P＜0.01）,低氧诱导16小时COX-2 mRNA高于常氧条件下的8倍（P＜0.05）。加入YC-1后COX-2mRNA量呈浓度依赖下降（F=37.1,P＜0.01）。常氧组、低氧8小时组、低氧16小时组、低氧24小时组E-cadherin mRNA表达量分别为47±14.8%、36.6±12.5%、18.7±4.0%、15.7±10.3%,4组间具有显著统计学差异（F=26.5,P＜0.01）,组间比较显示,低氧诱导16小时E-cadherinmRNA较常氧下降1.5倍（P＜0.05）。YC-1对低氧诱导的E-cadherin mRNA表达下调无明显影响,低氧组、低氧加YC-1 10μM组、低氧加YC-1 100μM组E-cadherin表达的量分别是18.7±4%、15.3±3.8%、17.0±4.0%,三组之间无统计学差异（F=0.54,P＞0.05）。结论低氧诱导肺腺癌细胞HIF-1α蛋白的表达上调,低氧条件下COX-2mRNA的上调与HIF-1α蛋白的上调有明显的内在联系,提示COX-2作为HIF-1α的靶向基因通过转录上调适应低氧。E-cadherin在低氧肺腺癌细胞的上调可能与HIF-1α的作用无关。YC-1作为HIF-1α的抑制剂在肺腺癌中具有同样作用,为今后的肺癌靶向治疗提供理论依据。三、低氧人肺腺癌A549细胞PGE2含量变化及对HIF-1α诱导作用的研究目的探讨COX-2代谢产物PGE2和选择性COX-2抑制剂NS398对低氧A549细胞HIF-1α蛋白表达的影响。方法采用ELISA试剂盒检测低氧诱导16小时人肺腺癌A549细胞PGE2含量变化,同时检测了加用不同浓度（10μM、100μM）选择性COX-2抑制剂NS398后持续低氧16小时PGE2含量的变化。采用Wesernblot检测外源性PGE2对常氧和低氧条件下HIF-1α蛋白表达的影响,同时检测了加用不同浓度（10uM、100uM）选择性COX-2抑制剂NS398后持续低氧16小时对HIF-1α蛋白表达的影响。结果低氧诱导条件下培养上清PGE2的含量（0.35±0.05ng/ml）明显高于常氧培养（0.22±0.03ng/ml）（t=5.6,P＜0.01）,加用NS398可明显降低低氧条件下PGE2的升高,且随着NS398浓度的升高PGE2下降明显（F=20.3,P＜0.01）。常氧对照组HIF-1α未见表达,常氧加用PGE2 100μM组HIF-1α蛋白表达为1.14±0.1,较常氧组明显增高。低氧组与低氧加PGE2组HIF-1α蛋白表达分别为1.45±0.09、2.31±0.27,二者具有明显的统计学差异（t=5.25,P＜0.01）。低氧组、低氧加NS398 10μM组和低氧加NS398 100μM组HIF-1α蛋白表达分别为1.45±0.09、0.72±0.12、0.29±0.09,3组间具有明显的统计学差异（F=212.3,P＜0.01）,且HIF-1α蛋白量的下降与NS398呈浓度依赖性,随着NS398浓度的增高,HIF-1α明显下降。结论在低氧诱导条件下人肺腺癌细胞系A549显示HIF-1α、COX-2/PGE2之间潜在的正反馈环路的存在,低氧诱导至HIF-1α蛋白稳定表达,上调COX-2的表达,导致PGE2升高,PGE2又可诱导HIF-1α的表达上调,提示了靶向COX-2和HIF-1α在肺腺癌中协同作用。
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