中枢神经系统药物的高效液相色谱—二极管阵列检测器系统分析

论文摘要

目的系统毒物分析（Systematical Toxicological Analysis,STA）是指针对未知存在和未知性质的毒药物进行的分析,它是旨在检测并鉴定生物体液中未知化合物的一种系统分析方法。本课题以成瘾性镇痛药、麻醉药、抗精神病药、苯二氮卓类等61种主要作用于中枢神经系统药物作为研究对象,通过研究通用的血浆样品预处理方法和色谱扫描方法,评价紫外光谱库和相对保留时间数据库在未知药物鉴定的可行性。建立临床常见中毒系统分析平台,实现对未知药物的快速鉴定。该研究对于临床急诊药物中毒病人的诊治具有重要和深远的意义。方法与结果1建立通用的梯度洗脱扫描方法并建立药物的紫外光谱库和相对保留时间（RRT）数据库扫描方法:采用乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相,0.0-30.0min,乙腈浓度从5%以1.5%/min升至50%;30.1-35.0min,乙腈浓度从50%以6%/min升至80%,两次进样的平衡时间为15 min;流速:1.5ml/min,温度为35℃;进样体积为30μL;扫描波长为200-364nm;检测波长为210nm和254nm;以1-硝基丁烷为内标。将适宜浓度的药物标准品溶液分别注入色谱柱,得到药物的相对保留时间及紫外光谱图,从而建立紫外光谱及RRT数据库。通过紫外光谱和RRT联合定性,实现对药物的鉴定。2建立通用的血浆样品预处理方法2.1蛋白沉淀方法1 mL血浆样品加入1.5 mL乙腈,旋涡混合后,离心,上清液过滤后直接采用HPLC测定。测试了61种包括酸性、碱性及中性药物,所有测试药物的回收率均大于80%,相对标准偏差（RSD）为0.94 %到11.23 %。2.1 WCX固相萃取方法柱子依次用3 mL乙腈、1mL水、2mL缓冲液活化后,将稀释后的血样上柱,加2mL水洗去杂质,加2mL乙腈洗脱（A层:中性和酸性洗脱层）;加3mL三氟乙酸-乙腈（2+98）洗脱（B层:碱性洗脱层）;A、B洗脱层分别在60℃氮气下吹至近干,加5%乙腈定容至1mL。53种药物的平均回收率超过50%,其中37种药物的平均回收率超过80%,RSD在0.08%至14.03 %之间。3评价紫外光谱与相对保留时间在未知药物鉴定的选择性以区分能力（Discrimination Power,DP）和平均列表长度（Mean List Length,MLL）评价紫外光谱库和RRT数据库在未知药物鉴定的可行性。同时考虑光谱特性和RRT,则DP=0.9995,MLL=1.0328,即平均地,每个物质只与自身以外的0.03个物质不能鉴别。4病例分析应用本文建立的方法对临床上48个中毒血浆样品进行扫描分析,其中37个样品检出,检出率为77.1%。结论1、乙腈沉淀蛋白可作为STA中通用的样品前处理方法。2、WCX固相萃取作为STA的样品前处理程序,需要其它方法加以补充。3、HPLC-DAD是系统毒物分析可行的、具有发展前景的方法。

论文目录

• 缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 系统毒物分析
• 1.2 本研究的主要内容、技术关键及创新性
• 1.2.1 主要内容
• 1.2.2 技术关键
• 1.2.3 创新性
• 1.3 样品预处理方法及其在系统毒物分析中的应用
• 1.3.1 液液萃取
• 1.3.2 固相萃取
• 1.3.2.1 反相机制的填料
• 1.3.2.2 混合机制的填料
• 1.3.3 蛋白沉淀
• 1.4 高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）系统
• 1.4.1 概述
• 1.4.2 HPLC-DAD 与其它分析方法的比较
• 1.4.2.1 毛细血管气相色谱-质谱联用
• 1.4.2.2 液相色谱-质谱联用
• 1.4.2.3 REDEMi 系统
• 1.4.2.4 免疫方法
• 1.4.3 HPLC-DAD 应用于系统毒物分析的优越性
• 1.5 样本的选择
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 标准溶液与缓冲液的配制
• 2.3 仪器
• 2.4 中毒药物库的建立
• 2.5 样品预处理程序
• 2.5.1 蛋白沉淀
• 2.5.1.1 乙腈沉淀蛋白
• 2.5.1.2 高氯酸沉淀蛋白
• 2.5.2 固相萃取
• 2.5.2.1 MCX 固相萃取
• 2.5.2.2 WCX 固相萃取
• 2.6 HPLC-DAD 检测
• 2.6.1 色谱条件
• 2.6.2 内标
• 2.6.3 中毒药物的标准紫外光谱库和相对保留时间数据库的建立
• 2.6.4 萃取回收率与最低检测限
• 2.7 未知药物鉴别和定量
• 2.7.1 SI 的计算
• 2.7.2 纯紫外光谱图的获得
• 2.7.3 鉴别与定量
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 样品预处理结果
• 3.1.1 沉淀蛋白法
• 3.1.1.1 高氯酸沉淀蛋白
• 3.1.1.2 乙腈沉淀蛋白
• 3.1.1.3 蛋白沉淀方法的比较
• 3.1.1.4 乙腈沉淀蛋白的优缺点
• 3.1.2 固相萃取
• 3.1.2.1 MCX 柱固相萃取
• 3.1.2.2 WCX 柱固相萃取
• 3.1.3 乙腈沉淀蛋白与WCX 固相萃取的比较
• 3.2 HPLC-DAD 检测系统
• 3.2.1 色谱条件
• 3.2.1.1 固定相
• 3.2.1.2 紫外检测波长的选择
• 3.2.1.3 洗脱方法
• 3.2.2 相对保留时间
• 3.2.3 紫外光谱库和相对保留时间数据库
• 3.2.4 紫外光谱鉴定
• 3.2.4.1 药物的紫外光谱图
• 3.2.4.2 重叠峰的鉴定
• 3.2.4.3 高浓度样品的鉴定
• 3.2.4.4 低浓度样品的鉴定
• 3.2.5 部分药物标准溶液及加标血浆的色谱图及三维色谱光谱图
• 3.3 评价紫外光谱与相对保留时间在未知药物鉴定的选择性
• 3.3.1 DP 与MLL 的定义
• 3.3.2 DP 与MLL 的计算
• 3.3.2.1 仅考虑SI 的DP 与MLL
• 3.3.2.2 仅考虑RRT 的DP 与MLL
• 3.3.2.3 同时考虑SI 与RRT 的DP 与MLL
• 3.3.3 从DP 与MLL 评价光谱结合保留时间鉴定物质的可行性
• 第四章 病例分析
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述