蒙古鲌ob基因克隆及表达

论文摘要

本文中的试验鱼——蒙古鮊购自南湖渔场,健康无病,雄鱼体长23.1cm,体重151.3g;雌鱼体长为25.2cm,体重155.6g。根据已知的人和鼠ob基因序列设计引物,引物中分别引入EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点,通过RT-PCR从蒙古鮊脂肪组织RNA中扩增到ob基因片段。将此片段与pBluescrip SK（+）载体同时用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切,电泳回收各自片段后连接并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞,涂布于含IPTG、X-gal和Amp+的琼脂糖平板,挑取乳白色的菌落,进行PCR扩增和双酶切鉴定,阳性克隆命名为pSK-ob,将此质粒送大连宝生物公司测序,首次获得蒙古鮊ob基因编码区438bp的序列。ob基因序列在不同物种之间具有很高的保守性。将此序列与人、鼠和猪的ob基因序列进行比较,发现蒙古鮊与人、鼠和猪ob基因核苷酸编码序列的同源性分别为82%、84%和99%;蒙古舶ob基因编码的蛋白leptin氨基酸序列与人、鼠和猪leptin蛋白氨基酸同源性分别为80.8%、78.8%和95.2%。定量取蒙古舶不同组织0.2g,提取其总RNA后,用半定量RT-PCR技术分析组织ob基因表达特异性,结果表明:ob基因在脂肪和肝脏组织中表达量最大,在心脏、脾脏、肌肉、脑、卵巢中表达量次之,在肾脏中表达很少,而在精巢和肠道组织中不表达。将含ob基因的克隆载体pSK-ob与表达载体pET-28a同时用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切,回收所需片段连接并转化后,涂布于含IPTG、X-gal和Kan+的琼脂糖平板,挑出乳白色的菌落,进行PCR扩增和酶切鉴定。鉴定过的阳性克隆子命名为pET-28 a-ob,转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析。在分子量20KD处有一融合蛋白,而融合蛋白前体分子量为4KD,则剩余蛋白分子量为16kD,此蛋白分子量与期望值一致,且在一定时间内,表达量随着时间的延长,蛋白含量增加。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 ob基因概念及其结构
• 1.2 瘦素概念和结构
• 1.3 瘦素生物学功能
• 1.3.1 瘦素与摄食调控
• 1.3.2 瘦素与影响食欲的肽类关系
• 1.3.3 瘦素与繁殖
• 1.3.4 瘦素与免疫
• 1.3.5 瘦素与骨量变化
• 1.3.6 瘦素与肥胖
• 1.3.7 影响瘦素分泌的因素
• 1.3.8 瘦素作用机制和信号转导途径
• 1.4 瘦素受体（ob-R）
• 1.4.1 瘦素受体结构
• 1.4.2 leptin受体表达部位及功能
• 1.4.3 leptin受体生物学功能
• 1.5 与肥胖相关的基因与蛋白
• 1.6 研究展望
• 2 目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验鱼
• 3.1.2 试验细菌
• 3.1.3 质粒和载体
• 3.2 重要仪器设备
• 3.3 主要生化试剂
• 3.4 主要试剂及溶液的配制
• 3.5 技术路线
• 3.6 方法
• 3.6.1 RNA提取
• 3.6.2 RT-PCR
• 3.6.3 DNA纯化回收
• 3.6.4 RT-PCR产物克隆与测序
• 3.6.5 PCR扩增
• 3.6.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.6.7 质粒的小量制备
• 3.6.8 ob基因的序列同源性分析
• 3.6.9 ob基因的原核表达
• 3.6.10 ob基因的组织表达特异性
• 4 结果与分析
• 4.1 ob基因克隆
• 4.1.1 RNA提取物
• 4.1.2 RT-PCR结果
• 4.1.3 克隆鉴定
• 4.1.4 测序结果及核苷酸同源性比较
• 4.1.5 leptin蛋白氨基酸序列同源性比较
• 4.2 ob基因的原核表达
• 4.3 ob基因的组织表达特异性
• 5 讨论
• 5.1 基因的克隆
• 5.2 序列分析
• 5.3 原核表达
• 5.4 组织表达特异性
• 小结
• 参考文献
• 致谢