神经干细胞和新生大鼠Corti氏器组织联合培养的实验研究

论文摘要

目前治疗重度感音神经性耳聋的主要方法还是人工耳蜗植入。螺旋神经节神经元的完整性是人工耳蜗植入的前提并直接关系着植入后的临床效果。对于重度感音神经性耳聋的患者，不管导致疾病的诱因为何，一般都有不同程度的内耳螺旋神经节神经元的损伤或退化，所以如何恢复内耳螺旋神经节神经元的完整性为耳科学的一大挑战。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）具有良好的组织相容性和多向分化潜能，在胚胎和成年啮齿类动物中广泛存在。神经干细胞不仅可分化为神经系统的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，而且，体内移植后对神经系统损伤和疾病均有一定的修复作用。研究表明，控制神经干细胞不断增殖和分化的因素十分复杂，常是多种因素共同作用的结果。如何能使神经干细胞向特定的细胞分化，仍是目前研究的热点。我们根据神经干细胞多潜能分化的生物学特征，提出了是否可以在体外模拟内耳的环境来诱导神经干细胞分化为螺旋神经节神经元的设想。本课题通过神经干细胞和新生一天SD大鼠的Corti氏器组织联合培养来定向诱导分化神经干细胞向螺旋神经节神经元转化，以期为临床治疗重度感音神经性耳聋提供新的思路。第一部分胚胎大鼠神经干细胞的体外培养和分化的研究【目的】探讨神经干细胞体外分离培养的方法、增殖特点和多向分化的特性。【方法】取孕12天SD大鼠的海马组织，采用机械分离的方法获得神经干细胞，并应用无血清神经元限定性培养基进行原代和传代培养。对培养的神经干细胞进行单克隆纯化，然后进行Nestin（巢蛋白）免疫组织化学鉴定；将获得的神经干细胞进行体外分化，对分化结果进行NF（Neurofilament，神经丝蛋白，为神经元标志抗原）、GFAP（Glial Fibrillary Acidic Protein，胶质原纤维酸性蛋白，为星形胶质细胞标志抗原）和GalC（Galactocerebroside，半乳糖脑苷脂，为少突胶质细胞标志抗原）免疫组织化学鉴定。在神经干细胞增殖和分化过程中进行细胞形态学观察。【结果】采用机械分离和无血清培养的方法可以获得大量的神经干细胞，体外培养达两个月之久仍能保持增殖活性；单克隆培养可获得神经干细胞球，对其进行Nestin免疫细胞鉴定为阳性，证明为神经干细胞；神经干细胞体外分化可获得各种神经终末细胞，NF、GFAP和GalC鉴定结果均为阳性，证明可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。【结论】应用机械分离和无血清神经元限定性培养基培养的方法可获得大量的神经干细胞，这些神经干细胞具有多向分化的潜能，可分化为神经元等多种神经终末细胞。第二部分新生SD大鼠内耳Corti氏器的分离与培养【目的】观察Corti氏器在神经干细胞全培液中的生长情况，为下一步神经干细胞和Corti氏器联合培养作准备。【方法】运用显微外科技术分离出新生一天SD大鼠的Corti氏器组织，利用贴壁培养的方法把Corti氏器组织放入DMEM／F12+B27培养基中培养，倒置相差显微镜和电镜观察Corti氏器在神经干细胞全培液中的生长情况。【结果】SD大鼠耳蜗Corti氏器在DMEM／F12+B27培养基中生长达三周之久仍保持良好的生长态势。培养一周，扫描电镜观察，毛细胞及其纤毛结构发育状况与体内基本相同；随着培养时间的延长，毛细胞及其纤毛等结构有部分缺失，但仍显示良好的生长趋势。【结论】新生大鼠耳蜗Corti氏器组织可以在神经干细胞全培液中生长，离体培养的Corti氏器中的毛细胞和纤毛等结构发育与体内情况近似。第三部分神经干细胞和Corti氏器联合培养【目的】研究神经干细胞和Corti氏器组织联合培养的情况以及神经干细胞的分化情况。【方法】运用神经干细胞分化液neuralbasical以及Transway Filter膜对神经干细胞和新生一天SD大鼠内耳Corti氏器组织进行联合培养，用毛细胞特异性标记物MysinⅦA和神经元的特异性标记物Dil进行免疫组织化学双标染色，倒置相差显微镜、电镜以及激光共聚焦显微镜对联合培养的情况进行观察和鉴定。【结果】共培养3～5天时，神经干细胞球离Corti氏器组织近侧首先开始分化，显示出神经干细胞球向Corti氏器组织趋化性生长和分化；联合培养十天，神经干细胞球分化出的神经纤维长入了Corti氏器组织；至联合培养两周，在外毛细胞区可以看到三条闪光的条带，在内毛细胞区可以看到一条闪光的条带，高倍显微镜下可以看到神经干细胞分化出的神经纤维嵌入Corti氏器组织内并形成清晰的纹路；扫描电镜观察，可以看到神经干细胞分化出的神经纤维穿过Transway Filter膜上的小孔向Corti氏器趋化性生长；免疫组化和激光共聚焦显微镜观察，可以看到绿色荧光antimysinⅦA和红色荧光神经质膜Dil的标记，并可以看到黄色的混合色，说明神经干细胞分化出的神经纤维和毛细胞在形态学上发生了连接。【结论】神经干细胞和新生SD大鼠Corti氏器组织不仅可以联合培养，而且神经干细胞在新生SD大鼠Corti氏器组织的诱导下发生分化并且向着Corti氏器组织趋化性生长，随着联合培养时间的延长，神经干细胞分化出的神经纤维嵌入Corti氏器组织并在内外毛细胞区域形成连接，至于神经干细胞是否已经分化为内耳螺旋神经节神经元尚待进一步实验证实。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 胚胎大鼠神经干细胞的体外培养和分化的研究
• 材料与方法
• 一、主要仪器设备
• 二、细胞培养试剂及器械
• 三、细胞鉴定试剂
• 四、神经干细胞全培液的配制
• 五、神经干细胞分化液的配制
• 六、神经干细胞的培养
• 七、培养细胞的观察与记录
• 八、神经干细胞的鉴定
• 九、神经干细胞的分化与鉴定
• 结果
• 一、神经干细胞的形态学观察
• 二、免疫组化染色鉴定的结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 新生SD大鼠内耳Corti氏器的分离与培养
• 材料与方法
• 一、主要仪器设备见第一部分
• 二、主要试剂和培液见第一部分
• 三、新生SD大鼠内耳Corti氏器的分离
• 四、Corti氏器的培养
• 观察与结果
• 一、观察
• 二、结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 神经干细胞和Corti氏器联合培养
• 材料与方法
• 一、主要仪器设备见第一部分
• 二、主要试剂和培液见第一部分
• 三、神经干细胞和Corti氏器联合培养
• 四、采用Transway Filter膜进行神经干细胞和Corti氏器共培养
• 五、联合培养的鉴定
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 展望
• 神经干细胞及其应用研究进展
• 一、神经干细胞的概念和生物学特征
• 二、神经干细胞的分布
• 三、神经干细胞的研究方法
• 1、体外培养
• 2、在体研究
• 3、神经干细胞系的建立
• 四、神经干细胞增殖分化的影响因素
• 1、各种生长因子对神经干细胞增殖分化的影响
• 2、神经干细胞所处组织环境的影响
• 3、神经干细胞分裂方式的影响
• 4、神经干细胞的跨胚层分化
• 五、神经干细胞的应用
• 1、神经干细胞移植替代修复损伤变性的神经细胞
• 2、充当基因治疗的理想载体
• 3、诱导内源性神经干细胞增殖分化修复神经损伤
• 六、神经干细胞内耳移植
• 七、展望
• 参考文献
• 读书期间在导师迟放鲁教授指导下所完成的工作
• 致谢