声动力学疗法对艾氏腹水瘤细胞杀伤效应的研究

论文摘要

肿瘤,特别是恶性肿瘤,是当前威胁人类健康的主要疾病之一。鉴于对肿瘤的病因和发病机理尚不清楚,有关肿瘤的治疗方法都不能从根本上解决问题。目前,治疗肿瘤的方法有很多种,包括放疗、化疗以及外科手术疗法等,以超声激活血卟啉治疗恶性肿瘤的声动力疗法（Sonodynamic therapy,SDT）就是其中之一。声动力疗法是在光动力疗法（Photodynamic therapy,PDT）的基础上建立和发展起来的一种治疗癌症新方法。该疗法是利用超声具有穿透深部组织并能聚焦于肿瘤部位的特性,激活相对无毒性且长时间富集于肿瘤组织的声敏剂,从而产生抗肿瘤因子杀伤肿瘤细胞。相对于PDT来说,SDT治疗肿瘤具有较强的针对性和对正常组织的无创伤性,因而有着良好的应用前景。近些年来,国内外学者就SDT杀伤肿瘤的作用机理开展了多学科的研究工作,并取得一定成果,提出了一系列声空化、自由基、脂质过氧化等理论机制,但其具体机制目前尚无定论。SDT可能受多种因素的影响,不同的声敏剂、超声参数以及所研究的生物系统模型等可能共同决定其抗肿瘤的机制和疗效。本论文在综合国内外研究进展的基础上,结合本实验室前期研究成果,依托国家国家自然科学基金项目“超声激活血卟啉抗肿瘤的细胞分子生物学机制”和“超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子生物学机制”的支持,采用频率为2.2 MHz的聚焦超声结合原卟啉Ⅸ（ProtoporphyrinⅨ,PPⅨ）对艾氏腹水瘤（Ehrlich ascetic rumor,EAT）细胞的杀伤作用进行研究,取得的实验结果如下:1.通过EAT细胞对一定浓度PPⅨ吸收的实验发现,PPⅨ进入EAT细胞内的吸收量并不随时间延长而无限增加,可能存在相对“饱和”。实验结果表明,在加入原卟啉20min后,肿瘤细胞对PPⅨ的吸收基本达到相对饱和状态,因此,最佳的PPⅨ孵育时间为20min。2.筛选聚焦超声结合PPⅨ杀伤EAT细胞的实验参数,结果发现声照强度、处理时间以及PPⅨ浓度均存在相对的损伤作用阈值:超声所诱导的细胞损伤存在一个强度阈值,大约在3 W/cm2,当大于这一阈值,细胞的破坏急剧增强;PPⅨ对于声动力学疗法诱导的细胞损伤存在相对较小范围的浓度剂量阈值（80μM）,当PPⅨ浓度低于这一阈值时,超声激活PPⅨ的协同杀伤效应不明显,当PPⅨ浓度大于这一阈值时,二者的联合作用表现显著增强;同时超声处理时间也存在一定的阈值（45 s）,小于这一阈值时,超声激活PPⅨ的联合作用与单纯超声组无明显差别,大于这一阈值时,PPⅨ显著增强了超声对细胞的杀伤作用。3.强度为3 W/cm2的聚焦超声结合80μmol/L PPⅨ作用于EAT细胞45 s时,对细胞的杀伤率达50.22%,同等条件下单纯超声对细胞的杀伤率仅为29.24%,单纯PPⅨ对细胞无明显的细胞毒作用。扫描电镜和透射电镜下观察不同处理组细胞的形态学变化表明PPⅨ-声动力学处理对EAT细胞的损伤主要表现在胞质内有空泡形成、线粒体膨胀和嵴消失、胞膜破损、胞质流失、核膜边界模糊及部分核膜破损出现核质流失、核内有空区、部分染色质凝集并趋边等。因此可推测超声结合PPⅨ对EAT细胞的损伤作用靶位点主要集中在细胞质膜、核膜以及线粒体等一些膜性细胞器上。4.通过免疫细胞化学检测超声结合PPⅨ处理EAT细胞,发现凋亡相关蛋白Caspase-3,细胞色素c,Smac/DAIBL0的表达发生显著的变化,提示在超声诱导EAT细胞死亡的过程中可能同时存在着线粒体凋亡途径。5.通过激光共聚焦显微镜检测PPⅨ在EAT细胞中的定位情况,发现PPⅨ与罗丹明123共定位,表明了PPⅨ主要定位于细胞中的线粒体,线粒体可能是超声结合PPⅨ杀伤EAT细胞的重要靶细胞器。6.通过激光共聚焦显微镜定性与酶标仪半定量检测线粒体膜电位变化,定性结果显示,单纯PPⅨ组的荧光与对照组相似,单纯超声组的荧光减弱,超声结合PPⅨ组的荧光进一步减弱。同时,半定量结果显示,单纯PPⅨ组的平均荧光强度与对照组无差异显著性;单纯超声组的平均荧光强度较对照组低,经差异显著性分析,其P值<0.01;但是超声结合PPⅨ组的平均荧光强度明显低于单纯超声组,经差异显著性分析,其P值<0.05。表明与对照组、单纯PPⅨ组,单纯超声组相比,超声结合PPⅨ组细胞的线粒体膜电位降低最为明显,说明超声结合PPⅨ使EAT细胞的线粒体功能受损。7.通过酶标仪半定量检测超声结合PPⅨ处理EAT细胞时,生成了活性氧,TBA显色法检测声化学处理对EAT细胞脂质过氧化水平的影响。实验结果显示:声化学处理后细胞悬液中活性氧含量明显升高,与其它三组相比均表现出极显著性差异（P值<0.01）;联合处理组细胞的脂质过氧化含量明显高于单纯超声组和单纯PPⅨ组,推测超声结合PPⅨ产生活性氧自由基攻击细胞膜造成膜脂质过氧化,可能是细胞死亡的原因之一。本研究选择PPⅨ研究声动力学疗法抗肿瘤的生物学特性,通过研究超声结合PPⅨ对EAT细胞的杀伤作用,初步探讨SDT杀伤肿瘤细胞的分子生物学机制,为卟啉类声敏剂药物筛选提供实验依据,从而为SDT早日应用于肿瘤的临床诊断和治疗积累相关资料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 研究背景
• 1.1 声动力学疗法研究进展
• 1.2 细胞凋亡与声动力学疗法
• 第2章 研究论文的立论依据、内容及目的意义
• 第3章 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞的杀伤效应研究
• 3.1 原卟啉Ⅸ在艾氏腹水瘤细胞中聚集情况的检测
• 3.1.1 原卟啉Ⅸ标准曲线的绘制
• 3.1.2 原卟啉Ⅸ在艾氏腹水瘤细胞中的富集实验
• 3.2 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ杀伤艾氏腹水瘤细胞的实验参数筛选
• 3.2.1 不同强度的聚焦超声对艾氏腹水瘤细胞的杀伤作用
• 3.2.2 超声结合不同浓度的原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞的杀伤作用
• 3.2.3 不同的声照处理时间对艾氏腹水瘤细胞的杀伤作用
• 3.2.4 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞存活率的影响
• 3.3 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ杀伤艾氏腹水瘤细胞的形态学观察
• 3.3.1 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ杀伤艾氏腹水瘤细胞的光镜观察
• 3.3.2 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ杀伤艾氏腹水瘤细胞的扫描电镜观察
• 3.3.3 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ杀伤艾氏腹水瘤细胞的透射电镜观察
• 第4章 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ杀伤艾氏腹水瘤细胞的生物学机制初探
• 4.1 原卟啉Ⅸ在艾氏腹水瘤细胞中的定位情况
• 4.2 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞线粒体膜电位的影响
• 4.3 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞中Caspase-3,细胞色素c,Smac/DIABLO蛋白表达的影响
• 4.4 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞内活性氧含量的影响
• 4.5 聚焦超声结合原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞内脂质过氧化水平的影响
• 结论
• 参考文献
• 图版及其说明
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果