德氏乳杆菌保加利亚亚种双组分信号转导蛋白HPK1和RR1的功能分析

论文摘要

德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）以其优良的发酵特性,在世界上广泛应用于各种发酵乳的生产,是一种具有很高经济价值的乳酸菌。尽管研究者对其进行了大量研究,但主要集中在发酵性能和应用方面的研究,而对该菌的代谢机制等方面研究甚少。双组分信号系统是细菌中一种重要的调控机制,参与调控pH变化、趋化性、孢子形成、细胞分裂、生物膜形成等多种生理生化过程以适应环境的变化。该系统由组氨酸蛋白激酶和应答调节蛋白两部分组成。近年来,研究者发现某些乳酸菌中存在着一些双组分信号系统,参与乳酸菌的耐酸性、粘附和定殖能力、细菌素合成等生理功能的调控。本论文以德氏乳杆菌保加利亚亚种CH3为实验材料,对该菌的双组分系统HPK1/RR1进行功能分析,旨在揭示其在耐酸和粘附调节中的作用。本研究通过构建自杀性载体pUC18-rr1-EM-1和pUC18-hpk1-EM-1,分别转化到野生型菌株中,筛选获得了hpk1和rr1的突变体CH3-H1和CH3-R1,并构建了相应的互补菌株CH3-H1C和CH3-R1C。对上述菌株与野生型菌株,进行生长速度、细菌形态、耐酸能力、生物膜形成能力的比较分析。结果发现,突变体生长速度明显低于野生型菌株;同时突变体耐酸能力下降,并且生物膜形成能力也降低。以上结果表明,HPK1/RR1是一个多效调控系统,可参与细菌耐酸能力、粘附能力和生长能力的调节。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 立题背景
• 1.2 双组分信号转导系统
• 1.2.1 组氨酸蛋白激酶
• 1.2.2 应答调控蛋白
• 1.2.3 双组分信号转导系统的作用机制
• 1.3 乳酸菌中双组分信号转导系统
• 1.3.1 耐酸性调控
• 1.3.2 细菌素的合成
• 1.3.3 粘附和定殖能力
• 1.4 突变体的构建
• 1.4.1 基因敲除的原理及步骤
• 1.4.2 自杀性质粒的构建及突变体的筛选
• 1.4.3 乳酸菌突变体的构建
• 1.5 本课题研究的目的及意义
• 1.6 本课题主要研究内容
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料及仪器
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶及试剂盒
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 常用试剂的配制
• 2.1.6 培养基的配制
• 2.1.7 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 不同抗生素筛选浓度的确定
• 2.2.2 德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组DNA 提取
• 2.2.3 PCR 技术特异性扩增目的基因
• 2.2.4 PCR 产物胶回收
• 2.2.5 细菌质粒DNA 的提取
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.7 重组质粒的快速鉴定方法
• 2.2.8 重组质粒测序鉴定
• 2.2.9 构建重组质粒 pUC18-rr1 和 pUC18- hpk1
• 2.2.10 构建重组质粒pUC18-111-EM-1、pUC18-111-EM-1、pUC18-hpk1-EM-2 和pUC18-hpk1-EM-2
• 2.2.11 电脉冲转化德氏乳杆菌保加利亚亚种
• 2.2.12 功能分析
• 第三章 突变体及互补体构建
• 3.1 不同抗生素筛选浓度确定
• 3.1.1 氨苄素青霉素（Amp）筛选浓度的确定
• 3.1.2 红霉素（Em）筛选浓度的确定
• 3.1.3 氯霉素（Cm）筛选浓度的确定
• 3.2 自杀性重组质粒 pUC18-rr1 和 pUC18-hpk1 构建
• 3.2.1 德氏乳杆菌保加利亚亚种 CH3 总 DNA 提取以及 PCR 特异性扩增 目的基因 hpk1 和 rr1
• 3.2.2 重组质粒酶切及PCR 鉴定
• 3.2.3 测序鉴定
• 3.3 重组质粒PUC18-111-EM-1、PUC18-111-EM-2、PUC18-hpk1-EM-1 和PUC18-hpk1-EM-2 构建
• 3.3.1 PCR 特异性扩增目的红霉素抗性基因片段
• 3.3.2 重组质粒pUC18-111-EM-1、pUC18-111-EM-2、pUC18-hpk1-EM-1 和pUC18-hpk1-EM-2 酶切鉴定
• 3.3.3 测序鉴定
• 3.4 突变体筛选
• 3.4.1 氨苄青霉素筛选突变体
• 3.4.2 红霉素筛选突变体
• 3.5 互补体筛选
• 3.5.1 氯霉素筛选互补体
• 3.6 本章小结
• 第四章 功能分析
• 4.1 德氏乳杆菌保加利亚亚种CH3 与突变体CH3-H1、CH3-R1 生长曲线差异分析
• 4.1.1 生长曲线测定
• 4.1.2 pH 测定
• 4.2 菌体形态差异分析
• 4.2.1 德氏乳杆菌保加利亚亚种CH3 不同时期菌体形态差异分析
• 4.2.2 突变体CH3-H1 和CH3-R1 不同时期菌体形态差异分析
• 4.3 耐酸功能分析
• 4.3.1 德氏乳杆菌保加利亚亚种CH3 耐酸试验
• 4.3.2 突变体CH3-R1 耐酸试验
• 4.3.3 突变体CH3-H1 耐酸试验
• 4.3.4 野生乳酸菌与突变体生长耐酸功能差异分析
• 4.4 粘附功能分析
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢