中药复方脑得生的有效成分组研究

论文摘要

缺血性中风属中医学“中风”范畴，是一种严重影响人类健康的常见病。其发病机制复杂，是一种多因素多途径相互作用的疾病，涉及到大量的生物活性物质，目前对其发病机制的研究尚未完全阐明。其病理机制主要有脑组织的能量代谢紊乱、自由基损伤、炎症反应、兴奋性氨基酸神经毒性作用、钙超载、凋亡相关基因的表达等。近年来，脑缺血的治疗主要是针对神经元的保护作用，减少梗塞面积，减少神经元的迟发性死亡等。本文以其发病机制为依据，对复方脑得生有效成分组的神经保护作用及其机制进行了深入研究。一、适合高通量筛选样品的制备本实验采用现代植物化学分离技术，制定规范的操作程序，将提取分离和层析等技术相结合，用不同溶剂对组方中原料药进行提取，将复方脑得生中的全部成分分为170个独立组分。其中，对乙醇部分进行硅胶柱层析，共计得到90个组分；对石油醚部分进行硅胶柱层析，共计得到80个组分。所有样品进行浓缩供下一步的筛选及研究用。二、对样品进行高通量筛选建立与脑得生功效主治相关的高通量筛选模型。根据脑得生的功效主治寻找与现代医学共同点，在细胞和分子水平上建立能够反映作用机理的筛选模型。缺血性脑损伤的发生主要与过氧化损伤、钙超载、兴奋毒性作用、炎症反应以及线粒体功能的受损等相关。因此，本研究中我们根据上述发病机制分别建立了相应的损伤模型，并对所得的170个组分进行了筛选。最后，将以上研究结果进行汇总，发现部分样品在不同模型上作用吻合，可能是脑得生发挥作用的活性物质，另外一些样品在多个模型作用强度较弱甚至相反，可能是影响脑得生疗效的部分。通过综合分析，将作用符合我们要求的组分按一定比例混合组成脑得生的有效成分组（2-11，16-21，25-29，31-35，38-41，47-52，59-73，95-99，116-119，122-127，131-136，167-170），进行高效液相成分分析，找出适合大规模生产的有效成分组。三、应用HPLC分析高通量筛选结果，实现生产工艺的转换分别将硅胶柱分离的醇溶部分和石油醚部分中的抗脑缺血有效成分，按其编号从其DMSO溶液中取出，按照各自得率，有机混合在一起作为有效成分组供检测用。分别将大孔树脂分离的30％、60％、90％乙醇沈脱物部分与抗脑缺血有效成分组做对比，通过HPLC分析寻找适合大规模生产的目的组分。由液相色谱图可以看出，脑得生有效成分主要分布在30％和60％乙醇洗脱物中。因此，我们将30％和60％乙醇洗脱物按比例混合作为新的复方脑得生的有效成分组（NECG），进行下一步的整体动物实验，对其疗效进行验证，并进一步进行机制研究。四、利用动物实验进行有效成分组的验证采用栓线法造成大鼠大脑中动脉阻断模型，通过预防性以及治疗性两种给药方式，从脑梗塞体积、行为学、脑组织能量代谢、病理学改变、炎症反应以及凋亡等多方面指标进行观察，全面评价了我们所确证的有效成分组的神经保护作用。实验结果表明，治疗性给药时NECG大剂量组（0.07 g／kg）可显著降低脑梗死体积、改善神经功能，并且可抑制炎症反应，以及凋亡的发生和发展；NECG中剂量组（0.02 g／kg）和小剂量组（0.007 g／kg）也有改善作用，但某些指标与模型组相比，没有显著性差异（P＞0.05）。造模前先连续给予7天药物时，与模型组以及治疗给药的实验结果比，药物的保护作用则更加明显，尤其NECG中剂量组表现出了明显的保护作用。另外，我们同时与原方的疗效进行了对照研究，实验结果说明NECG的疗效明显优于原方。五、体外对其作用机制进一步探讨实验结果表明，NECG对神经细胞的保护作用机理不是单一的，其药效是多种机理综合作用的结果。1、NECG能抑制过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡。实验结果表明，NECG可显著改善过氧化氢引起的细胞存活率的降低；流式细胞仪分析表明100μg／ml和10μg／ml的NECG均能显著改善过氧化氢引起的凋亡；Western Blotting的分析结果显示，100μg／ml和10μg／ml NECG能够明显抑制过氧化氢诱导的Bcl-2蛋白表达的下调和Bax蛋白表达的上调，使Bcl-2／Bax比值上升，还能明显抑制细胞色素C从线粒体的释放以及p53的活化；同时，预先加入NECG还可明显抑制过氧化氢损伤引起的caspase-3的活化，使其活性降低。2、NECG能够抑制叠氮钠诱导的PC12细胞凋亡。我们的实验结果首先证明了叠氮钠诱导的凋亡伴随有细胞内ROS时间依赖性的产生增多，并且与凋亡的线粒体途径改变密切相关。同时，我们的实验结果也提示，NECG可剂量依赖性的显著改善上述改变：NECG可改善细胞存活率和凋亡率，降低细胞内ROS的增多，100μg／ml和10μg／ml的NECG能够抑制叠氮钠诱导的Bcl-2表达的下调和Bax蛋白表达的上调，使Bcl-2和Bax比值上调，预先加入NECG能明显抑制叠氮钠损伤引起的细胞色素C自线粒体的释放以及caspase-3的活化，从而有效的降低了细胞凋亡的发生。3、NECG有改善线粒体功能的作用。NECG体外能够抑制50μmoL／L FeSO4／500μmoL／L半胱胺酸损伤体系诱导的线粒体MDA生成的增加，降低脂质过氧化的发生率，具有明显的保护线粒体免遭氧化损伤的作用；可减轻线粒体肿胀度，维持线粒体的膜电位，抑制H+-ATP酶活性的降低，从而保护了线粒体的结构和功能；NECG还可抑制GSH含量的降低，保护了线粒体内源性抗氧化物质，从而使氧自由基的生成与清除保持平衡，使线粒体膜免遭损伤。因此，NECG抗细胞凋亡的作用机制一方面和清除氧自由基有关，另一方面NECG可能通过直接影响p53的表达，细胞色素C的释放、caspase-3活性或者通过调控Bcl-2、Bax的蛋白表达间接影响线粒体依赖的caspase-3途径来抑制细胞凋亡。六、结论研究结果表明，中药复方脑得生对脑缺血有显著的防治作用，这种作用的物质基础是其中多种有效成分的有机组合，这些成分通过不同的作用途径和相互影响，产生综合作用，实现对脑缺血疾病的预防和治疗作用。药效成分组的作用机制研究证明中药有效成分组通过不同的成分从不同的途径发挥作用，如抗过氧化损伤、抑制细胞凋亡以及减轻炎症反应等。结果证明有效成分组可以比较合理的代表了中药的整体作用，反映了中药复方的作用特点。本实验结果也证明，应用高通量筛选方法研究中药复方具有一定的技术优势，也是行之有效的方法。

论文目录

中文摘要

ABSTRACT

引言

参考文献

第一部分制备适合高通量药物筛选的脑得生样品

前言

（一）脑得生不同极性成分的分离提取

（二）石油醚部分分离流程

（三）乙醇部分分离流程

（四）结果

讨论

小结

第二部分脑得生功效相关高通量筛选模型的建立及全成分的筛选

前言

第一节脑得生全组分对兴奋性氨基酸神经毒性作用的影响

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 谷氨酸损伤模型建立

2.2 脑得生全组分对谷氨酸损伤的保护作用

第二节脑得生全组分对过氧化氢致神经细胞损伤的保护作用

1.材料与方法

2.实验结果

2O₂损伤模型建立'>2.1 H₂O₂损伤模型建立

2.2 脑得生所有组分对过氧化氢损伤的保护作用

第三节脑得生全组分对炎症细胞损伤模型的保护作用

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 类小神经胶质细胞的建立

2.2 脑得生全组分对炎症损伤的影响

第四节脑得生全组分对线粒体损伤模型的保护作用

（一）脑得生全组分对叠氮钠致PC12细胞损伤模型的保护作用

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 叠氮钠损伤模型建立

2.2 脑得生不同组分对叠氮钠致PC12细胞损伤的保护作用

（二）脑得生全组分对鱼藤酮致PC12细胞损伤模型的保护作用

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 鱼藤酮损伤模型建立

2.2 脑得生全组分对鱼藤酮致PC12细胞损伤的作用

（三）脑得生全组分对体外线粒体损伤的保护作用

1.材料与方法

2.实验结果

第五节高通量筛选结果汇总

讨论

小结

参考文献

第三部分脑得生有效成分组制备方法研究

前言

第一节脑得生组成及成分研究概况

1.脑得生组方

2.提取方法

乙醇提取物的大孔树脂分离

第二节制备方法的筛选与优化

1.HPLC实验条件

2.实验方法

3.实验结果

3.1 乙醇洗脱物Ⅰ部分与抗脑缺血有效成分的对比

3.2 乙醇洗脱物Ⅱ部分与抗脑缺血有效成分的对比

3.3 乙醇洗脱物Ⅲ部分与抗脑缺血有效成分的对比

3.4 石油醚提取物与抗脑缺血有效成分的对比

讨论

小结

参考文献

第四部分 NECG体内抗脑缺血作用及其作用机制研究

前言

第一节 NECG对永久性局灶脑缺血损伤的治疗作用

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

3.1 NECG治疗性给药对脑缺血大鼠行为学指标的影响

3.2 NECG治疗性给药对脑缺血大鼠神经功能缺陷评分的影响

3.3 NECG治疗性给药对脑缺血大鼠脑缺血面积的影响

3.4 NECG治疗性给药对脑缺血大鼠脑组织含水量的影响

3.5 NECG治疗性给药对缺血大鼠脑组织SOD的影响

3.6 NECG治疗性给药对脑缺血大鼠脑组织MDA含量的影响

3.7 NECG治疗性给药对缺血大鼠脑组织ATP酶活性的影响

3.8 NECG治疗性给药对脑缺血大鼠脑组织NO水平的影响

第二节 NECG对缺血脑组织炎症反应的抑制作用

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

3.1 NECG对永久性局灶脑缺血大鼠脑组织IL-6水平的影响

3.2 NECG对永久性局灶脑缺血大鼠脑组织TNF-α水平的影响

第三节 NECG对缺血脑组织神经细胞凋亡的作用及其机制研究

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

3.1 NECG治疗性给药对线粒体功能的影响

3.2 NECG对缺血侧海马CA1区神经元活性的影响

3.3 NECG对缺血区海马神经元Bax以及caspase-3表达的影响

第四节 NECG对永久性局灶脑缺血损伤的预防作用

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

3.1 NECG预防性给药对大鼠行为学指标的改善作用

3.2 NECG预防性给药对脑缺血大鼠神经功能缺陷评分的影响

3.3 NECG预防性给药对脑缺血大鼠脑缺血面积的影响

3.4 NECG预防性给药对脑缺血大鼠脑组织含水量的影响

3.5 NECG预防性给药对缺血大鼠脑组织SOD活性的影响

3.6 NECG预防性给药对脑缺血大鼠MDA含量的影响

3.7 NECG预防性给药对缺血大鼠脑组织ATP酶活性的影响

3.8 NECG预防性给药对脑缺血大鼠NO的影响

第五节 NECG预防性给药对缺血脑组织炎症反应的作用

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

3.1 NECG对永久性局灶脑缺血大鼠脑组织IL-6水平的影响

3.2 NECG对永久性局灶脑缺血大鼠脑组织TNF-α水平的影响

第六节 NECG预防给药对缺血脑组织神经细胞凋亡的作用及其机制研究

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

3.1 NECG预防性给药对线粒体功能的影响

3.2 NECG对脑缺血大鼠海马CA1区神经元活性的影响

3.3 NECG对缺血区海马神经元Bax、caspase-3表达的影响

讨论

小结

参考文献

第五部分 NECG体外抗脑缺血作用机制的研究

前言

第一节 NECG对过氧化氢诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 细胞存活率测定

2.2 细胞形态学分析

2O₂诱导PC12细胞凋亡的影响'>2.3 流式细胞仪分析NECG对H₂O₂诱导PC12细胞凋亡的影响

2O₂诱导PC12细胞Caspase-3活性的影响'>2.4 NECG对H₂O₂诱导PC12细胞Caspase-3活性的影响

2O₂诱导PC12细胞Bcl-2、Bax、P53蛋白表达的影响'>2.5 NECG对H₂O₂诱导PC12细胞Bcl-2、Bax、P53蛋白表达的影响

2O₂诱导PC12细胞Cytochrome C释放的影响'>2.6 NECG对H₂O₂诱导PC12细胞Cytochrome C释放的影响

第二节 NECG对叠氮钠诱导PC12细胞凋亡的影响

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 细胞存活率测定

2O₂诱导的PC12细胞Caspase-3活性的影响'>2.2 NECG对H₂O₂诱导的PC12细胞Caspase-3活性的影响

2.3 NECG对叠氮钠诱导的PC12细胞内ROS含量的影响

2.4 NECG对Bcl-2,Bax蛋白表达以及细胞色素C释放的影响

第三节 NECG对线粒体功能的改善作用

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 NECG对线粒体膜肿胀度的影响

2.2 线粒体膜电位（△ψ）的测定

2.3 脂质过氧化产物MDA测定

2.4 还原型谷胱甘肽GSH的测定

+-ATP酶活性测定'>2.5 H⁺-ATP酶活性测定

讨论

小结

参考文献

第六部分复方中部分已知成分的作用研究

前言

第一节已知化合物对线粒体氧化损伤的保护作用

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 已知化合物对线粒体肿胀度的影响

2.2 已知化合物对线粒体膜电势的影响

2.3 已知化合物对线粒体MDA含量的影响

2.4 已知化合物对线粒体GSH含量的影响

第二节复方中部分已知化合物对过氧化氢致PC12损伤的保护作用

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 已知化合物对细胞存活率的影响

2.2 TMP对细胞存活率的影响

2.3 TMP对细胞形态的影响

2.4 TMP对细胞凋亡率的影响

2.5 TMP对Caspase-3活性的影响

2.6 TMP对细胞色素C的影响

2.7 TMP对凋亡相关蛋白表达的影响

第三节已知化合物对叠氮钠致PC12细胞损伤的作用

1.材料与方法

2.实验结果

2.1 已知化合物对细胞存活率的影响

2.2 Hyp对细胞存活率的影响

2.3 Hyp对细胞凋亡形态的影响

2.4 Hyp对细胞凋亡率的影响

2.5 Hyp对细胞caspase-3活性的影响

2.6 Hyp对细胞内ROS含量的影响

2.7 Hyp对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

讨论

小结

第七部分综合讨论

综述:线粒体疾病研究新进展

缩略词表（ABBREVIATIONS）

中药复方脑得生的有效成分组研究

论文摘要

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