拟南芥AtPLC3和AtPLC4参与盐胁迫应答的功能研究

论文摘要

植物响应盐胁迫的信号转导过程是一个巨大而复杂的网络,目前有很多关键的信号组分有待深入认识。肌醇磷脂依赖的磷脂酶C（PI-PLC,以后简称PLC）是肌醇磷脂信号系统中的一个关键酶,也是与植物耐盐性相关的候选基因。该信号系统在动植物细胞的生长发育及介导胞外信号的跨膜传递中发挥着重要的作用,其作用的分子机制已经成为目前研究的热点。随着2000年拟南芥基因组测序工作的完成,已分离并鉴定出21种不同的PLC和类PLC基因。研究不同PLC亚型基因参与调节的生理过程,可以为PLC的功能研究和作用机制的探讨提供重要的依据。通过基因改造为改良农作物的耐盐性状提供理论基础,进而为提高农作物产量和改善盐碱地区生态环境做出贡献。本研究以两种拟南芥PLC亚型AtPLC3与AtPLC4的突变体为材料,利用反向遗传学的方法,通过遗传转化、RT-PCR等分子生物学及组织化学分析并结合生理生化指标检测等试验手段,进行PLC参与调节植物耐盐性的功能研究。对购自SALK库的拟南芥AtPLC3与AtPLC4两个亚型基因的T-DNA插入突变体进行筛选和鉴定。用Kanr平板筛选与PCR的方法结合鉴定得到了两个亚型基因的T-DNA插入纯合突变体,并用RT-PCR检测了突变体中两个基因表达情况,P3为缺失突变体,P4为超表达突变体。利用不同NaCl浓度的MS培养基平板,分别检测了P3和P4的萌发速率和幼苗存活率,发现P3和P4两个突变体的萌发速率在NaCl处理条件下明显快于野生型,在100mM NaCl浓度下,P3和P4突变体的存活率均比Col的存活率高30%左右;进一步检测了两种突变体在盐胁迫条件下脯氨酸、SOD、POD等含量的变化,发现两种突变体脯氨酸上升的幅度小于野生型拟南芥,而SOD、POD活性水平均高于野生型。这些结果表明AtPLC3与AtPLC4亚型基因可能参与了拟南芥盐胁迫响应的调节。构建了AtPLC3与AtPLC4两个基因的组织定位和亚细胞定位转基因表达载体,取得遗传转化的阳性植株,经GUS染色和激光共聚焦显微镜观察,结果表明AtPLC3与AtPLC4均在根及叶片有较高水平的表达,这一结果也为前面的主根和侧根的表型提供了的试验证据;激光共聚焦显微镜观察结果发现两个亚型的蛋白定位于质膜上。这些定位信息为进一步研究两个亚型参与拟南芥盐胁迫应答调节的作用机制的研究提供了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 磷脂酶C的生理功能及研究现状
• 1.2 植物耐盐性研究进展
• 1.3 磷脂酶C与植物耐盐性
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 试剂和工具酶
• 2.1.5 培养基配方
• 2.1.6 引物合成及DNA序列测定
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 拟南芥12种PLC亚型同源性分析
• 2.2.2 拟南芥的种植
• 2.2.3 拟南芥P3与P4突变纯合体的鉴定
• 2.2.4 RT-PCR分析
• 2.2.5 盐胁迫条件下的拟南芥表型观察与生理指标检测
• 2.2.6 AtPLC3与AtPLC4启动子及cDNA的扩增与载体构建
• 2.2.7 RNAi载体构建
• 2.2.8 拟南芥的遗传转化
• 2.2.9 转基因植株的GUS染色
• 2.2.10 基因枪转化
• 3 结果与分析
• 3.1 拟南芥12种PLC亚型基因同源性分析
• 3.2 P3和P4突变纯合体的PCR鉴定及RT-PCR检测
• 3.3 AtPLC3和AtPLC4在盐胁迫刺激下表达量的变化
• 3.4 P3和P4突变体插入T-DNA拷贝数的鉴定
• 3.5 盐胁迫条件下拟南芥突变体表型特征
• 3.5.1 种子萌发
• 3.5.2 幼苗存活率
• 3.5.3 根部生长表型的检测
• 3.6 盐胁迫条件下生理指标检测
• 3.6.1 可溶性糖含量测定
• 3.6.2 脯氨酸含量测定
• 3.6.3 MDA含量测定
• 3.6.4 POD活性测定
• 3.6.5 SOD活性测定
• 3.7 载体构建结果
• 3.8 拟南芥的遗传转化结果
• 3.8.1 转基因植株的筛选和鉴定
• 3.8.2 转基因植株的PCR及RT-PCR鉴定
• 3.8.3 AtPLC3和AtPLC4基因的组织表达及亚细胞定位检测
• 4 讨论
• 4.1 利用反向遗传学方法研究拟南芥磷脂酶C的功能
• 4.2 AtPLC3和AtPLC4基因参与盐胁迫应答的生理过程调节
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢
• 附发表论文