本文主要研究内容
作者马宇聪（2019）在《抗PEDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立》一文中研究指出：猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)感染猪引起的肠道传染性疾病。患病仔猪主要临床特征为呕吐,腹泻,严重脱水等症状。近几年该病在我国的流行范围明显扩大,病原致病性亦有增强趋势,是当前仔猪腹泻死亡的重要病因之一。临床表现上,猪流行性腹泻与其他猪病毒性腹泻病临床症状上极为相似,因此,需要进行实验室鉴别诊断。其中ELISA特异性强,灵敏度高,可批量化检测,对本病病原检测具有重要价值。为获得ELISA主要检测试剂,本研究制备了抗PEDV单克隆抗体。以Vero细胞繁殖PEDV,将病毒培养物梯度密度离心纯化后,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和多次筛选获得了三株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为43B6-H2,75E2-F3,27C9-C5-D8。三株单克隆抗体经亚型鉴定均为Ig M亚型;间接ELISA测定杂交瘤细胞上清液抗体效价分别为1:6400;1:3200;1:3200;Western blot结果显示,三株单克隆抗体均能特异性与PEDV结构蛋白发生反应,但反应发生的结构蛋白大小不同,43B6-H2和75E2-F3识别相同分子大小的蛋白,在25-35KD之间。27C9-C5-D8识别约55KD蛋白,分别应对应于PEDV M蛋白和N蛋白,对三株单克隆抗体进行的叠加ELISA结果也表明,43B6-H2和75E2-F3识别同一个抗原表位,而27C9-C5-D8识别不同的抗原位点;间接免疫荧光结果表明,三株单克隆抗体与感染PEDV的Vero细胞反应,均能产生特异性荧光信号,而与感染猪传染性胃肠炎病毒的细胞不发生反应;综上所述,所制备的三株单克隆抗体对PEDV具有良好的特异性,为PED病原的诊断提供了重要的物质基础。在PEDV单克隆抗体制备的基础上,利用纯化的兔抗PEDV血清作为捕获抗体,过氧化物酶标记的单克隆抗体为检测试剂,通过各项条件的优化,建立了双抗体夹心ELISA检测PEDV主要反应条件:即将兔抗PEDV多抗稀释为浓度为2.8μg/m L,每孔加入100μL,37℃包被1 h之后包被过夜,取出后,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤5 min;然后加入5%脱脂乳200μL/孔封闭过夜,取出后,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤5 min,之后加入病毒培养物200μL,或者用磷酸盐缓冲液等比稀释的粪便样品200μL,37℃作用90min,甩去样品液,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤,每次5 min,加入浓度为7.5μg/m L的酶标记单抗,每孔加入100μL,37℃条件作用90 min,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤,每次5 min,每孔加入100μL的TMB显色液工作液,37℃避光显色10 min后,每孔加入50μL终止液,终止显色,OD450nm测定。本检测方法不与猪传染性胃肠炎(TGE),猪轮状病毒(Po RV),发生交叉反应;其病毒最低检测限度为3.125×103TCID50/m L;板内阳性样品变异系数为1.22%-3.66%,板内阴性样品变异系数为2.90%-8.72%;板间阳性变异系数为3.76%-7.03%,板间阴性样品变异系数为3.62%-9.32%,所有变异系数均小于10%。通过对47份病料的初步检测并与RT-PCR方法和金标免疫层析试纸条检测结果进行对比,检测结果显示,RT-PCR检测为阴性的样品,双抗体夹心ELISA和金标免疫层析试纸条检测也均为阴性;RT-PCR方法检测出的21份阳性样品,双抗体夹心ELISA共检测出19份阳性样品,金标免疫层析试纸条共检测只有14份阳性样品。从结果看,本方法的阳性检出率是介于RT-PCR和金标免疫层析试纸条之间。
Abstract
zhu liu hang xing fu xie (Porcine Epidemic Diarrhea,PED)shi you zhu liu hang xing fu xie bing du (Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)gan ran zhu yin qi de chang dao chuan ran xing ji bing 。huan bing zai zhu zhu yao lin chuang te zheng wei ou tu ,fu xie ,yan chong tuo shui deng zheng zhuang 。jin ji nian gai bing zai wo guo de liu hang fan wei ming xian kuo da ,bing yuan zhi bing xing yi you zeng jiang qu shi ,shi dang qian zai zhu fu xie si wang de chong yao bing yin zhi yi 。lin chuang biao xian shang ,zhu liu hang xing fu xie yu ji ta zhu bing du xing fu xie bing lin chuang zheng zhuang shang ji wei xiang shi ,yin ci ,xu yao jin hang shi yan shi jian bie zhen duan 。ji zhong ELISAte yi xing jiang ,ling min du gao ,ke pi liang hua jian ce ,dui ben bing bing yuan jian ce ju you chong yao jia zhi 。wei huo de ELISAzhu yao jian ce shi ji ,ben yan jiu zhi bei le kang PEDVchan ke long kang ti 。yi Veroxi bao fan shi PEDV,jiang bing du pei yang wu ti du mi du li xin chun hua hou ,mian yi BALB/cxiao shu ,tong guo xi bao rong ge 、ke long he duo ci shai shua huo de le san zhu wen ding fen bi kang PEDVchan ke long kang ti de za jiao liu xi bao zhu ,fen bie ming ming wei 43B6-H2,75E2-F3,27C9-C5-D8。san zhu chan ke long kang ti jing ya xing jian ding jun wei Ig Mya xing ;jian jie ELISAce ding za jiao liu xi bao shang qing ye kang ti xiao jia fen bie wei 1:6400;1:3200;1:3200;Western blotjie guo xian shi ,san zhu chan ke long kang ti jun neng te yi xing yu PEDVjie gou dan bai fa sheng fan ying ,dan fan ying fa sheng de jie gou dan bai da xiao bu tong ,43B6-H2he 75E2-F3shi bie xiang tong fen zi da xiao de dan bai ,zai 25-35KDzhi jian 。27C9-C5-D8shi bie yao 55KDdan bai ,fen bie ying dui ying yu PEDV Mdan bai he Ndan bai ,dui san zhu chan ke long kang ti jin hang de die jia ELISAjie guo ye biao ming ,43B6-H2he 75E2-F3shi bie tong yi ge kang yuan biao wei ,er 27C9-C5-D8shi bie bu tong de kang yuan wei dian ;jian jie mian yi ying guang jie guo biao ming ,san zhu chan ke long kang ti yu gan ran PEDVde Veroxi bao fan ying ,jun neng chan sheng te yi xing ying guang xin hao ,er yu gan ran zhu chuan ran xing wei chang yan bing du de xi bao bu fa sheng fan ying ;zeng shang suo shu ,suo zhi bei de san zhu chan ke long kang ti dui PEDVju you liang hao de te yi xing ,wei PEDbing yuan de zhen duan di gong le chong yao de wu zhi ji chu 。zai PEDVchan ke long kang ti zhi bei de ji chu shang ,li yong chun hua de tu kang PEDVxie qing zuo wei bu huo kang ti ,guo yang hua wu mei biao ji de chan ke long kang ti wei jian ce shi ji ,tong guo ge xiang tiao jian de you hua ,jian li le shuang kang ti ga xin ELISAjian ce PEDVzhu yao fan ying tiao jian :ji jiang tu kang PEDVduo kang xi shi wei nong du wei 2.8μg/m L,mei kong jia ru 100μL,37℃bao bei 1 hzhi hou bao bei guo ye ,qu chu hou ,yong xi ban ji xi ban 3ci ,mei ci mei kong jia ru 200μLde 1×lin suan yan tu wen huan chong ye xi di 5 min;ran hou jia ru 5%tuo zhi ru 200μL/kong feng bi guo ye ,qu chu hou ,yong xi ban ji xi ban 3ci ,mei ci mei kong jia ru 200μLde 1×lin suan yan tu wen huan chong ye xi di 5 min,zhi hou jia ru bing du pei yang wu 200μL,huo zhe yong lin suan yan huan chong ye deng bi xi shi de fen bian yang pin 200μL,37℃zuo yong 90min,shuai qu yang pin ye ,yong xi ban ji xi ban 3ci ,mei ci mei kong jia ru 200μLde 1×lin suan yan tu wen huan chong ye xi di ,mei ci 5 min,jia ru nong du wei 7.5μg/m Lde mei biao ji chan kang ,mei kong jia ru 100μL,37℃tiao jian zuo yong 90 min,yong xi ban ji xi ban 3ci ,mei ci mei kong jia ru 200μLde 1×lin suan yan tu wen huan chong ye xi di ,mei ci 5 min,mei kong jia ru 100μLde TMBxian se ye gong zuo ye ,37℃bi guang xian se 10 minhou ,mei kong jia ru 50μLzhong zhi ye ,zhong zhi xian se ,OD450nmce ding 。ben jian ce fang fa bu yu zhu chuan ran xing wei chang yan (TGE),zhu lun zhuang bing du (Po RV),fa sheng jiao cha fan ying ;ji bing du zui di jian ce xian du wei 3.125×103TCID50/m L;ban nei yang xing yang pin bian yi ji shu wei 1.22%-3.66%,ban nei yin xing yang pin bian yi ji shu wei 2.90%-8.72%;ban jian yang xing bian yi ji shu wei 3.76%-7.03%,ban jian yin xing yang pin bian yi ji shu wei 3.62%-9.32%,suo you bian yi ji shu jun xiao yu 10%。tong guo dui 47fen bing liao de chu bu jian ce bing yu RT-PCRfang fa he jin biao mian yi ceng xi shi zhi tiao jian ce jie guo jin hang dui bi ,jian ce jie guo xian shi ,RT-PCRjian ce wei yin xing de yang pin ,shuang kang ti ga xin ELISAhe jin biao mian yi ceng xi shi zhi tiao jian ce ye jun wei yin xing ;RT-PCRfang fa jian ce chu de 21fen yang xing yang pin ,shuang kang ti ga xin ELISAgong jian ce chu 19fen yang xing yang pin ,jin biao mian yi ceng xi shi zhi tiao gong jian ce zhi you 14fen yang xing yang pin 。cong jie guo kan ,ben fang fa de yang xing jian chu lv shi jie yu RT-PCRhe jin biao mian yi ceng xi shi zhi tiao zhi jian 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自东北农业大学的马宇聪，发表于刊物东北农业大学2019-08-27论文，是一篇关于猪流行性腹泻病毒论文,单克隆抗体论文,双抗体夹心论文,东北农业大学2019-08-27论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自东北农业大学2019-08-27论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。