低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应的影响及转录因子CBF1的克隆与转化

论文摘要

黄瓜是重要的蔬菜作物之一,世界各地普遍栽培。黄瓜属于喜温作物,早春季节经常受到低温的危害,日光温室黄瓜冬春季节则易受低温影响。我国劳动人民经长期实践得出了低温锻炼能增强黄瓜抗冷能力的经验,多年来的大量试验也证明了低温锻炼确实能增强植物耐冷能力。但选取多低的温度和多长时间进行锻炼效果最好,目前尚无定论。植物的一切生命活动均受遗传物质的控制,目前已从多种植物中克隆出了耐寒基因,其中转录因子CBF能激活耐寒基因的表达,CBF超表达能提高植物的耐寒能力。本试验选取不同低温对黄瓜幼苗进行锻炼,以探寻最佳锻炼温度及时间。另外从经过低温锻炼的黄瓜幼苗中克隆出黄瓜CBF1基因,并构建表达载体,成功转入抗病但不耐寒黄瓜自交系,转基因植株耐寒能力明显增强。具体结果如下:1、以耐寒自交系S11和冷敏感自交系S22为试材,以10/4℃、10/6℃、10/8℃三种温度处理,对三叶一心期幼苗进行低温锻炼。结果表明:10/4℃锻炼导致黄瓜幼苗SOD、POD、CAT保护酶活性下降,Vc含量降低,根系活力降低,冷害指数增加,电解质渗透率增加,这说明10/4℃锻炼已对幼苗造成冷伤害;10/6℃和10/8℃锻炼使黄瓜幼苗SOD、POD、CAT保护酶活性大幅提高,Vc含量升高,减少了活性氧的危害,可溶性糖和可溶性蛋白含量增加,丙二醛含量下降,冷害指数显著降低,根系活力上升,这说明10/6℃和10/8℃锻炼能增强幼苗的抗冷能力。综合评价对耐寒自交系S11来说,以10/6℃锻炼3d效果最好,冷敏感自交系以10/6℃锻炼2d效果最好。2、以耐寒自交系S11为试材,研究低温锻炼对黄瓜幼苗叶片叶肉细胞超微结构的影响。结果表明:正常条件下的黄瓜幼苗,叶绿体结构完整,基粒多,基粒片层排列紧密,整个膜系统完整。冷胁迫导致叶绿体结构变形,基粒片层松散无序,叶绿体膜受到严重损伤,冷胁迫后受伤的膜系统不能立即修复,反而受损伤程度加重。低温锻炼增强了黄瓜幼苗抗冷能力,使幼苗在冷胁迫条件下维持膜系统较完整状态,叶绿体受损轻,基粒片层排列较紧密,冷胁迫后膜系统修复也较快,这初步说明,适宜的低温锻炼使黄瓜幼苗在冷胁迫下维持膜系统,尤其是叶绿体的较完整性,从而减轻了冷伤害。3、以耐寒能力强的黄瓜‘山农5号’为试材,以拟南芥CBF1基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR方法,从低温锻炼的幼苗叶片中克隆出黄瓜CBF1基因,该基因长671bp,推导的氨基酸序列为213个氨基酸,与GenBank中的同源序列比较,本试验克隆的基因与拟南芥的基因在编码区完全相同,仅在起始密码子5’上游存在部分差异,与无包芥、高山离子芥、马蔺等同源性也很高。用SacI和SacII消化pCBF1,获得CBF1基因,用SacI和BamHI对pROK2双酶切,回收大片断,然后进行连接,构建了黄瓜转录因子CBF1基因的正义表达载体,经SacI和HindIII双酶切鉴定,证明了该基因已经成功连入pROK2中,命名为pROK2-CBF1。该载体的构建,为开展转基因研究,以提高植物抗寒、抗旱、抗盐等逆境及基因功能分析,提供了保障。4、利用花粉管通道途径转化的优势,采用子房微量注射的方式,将重组质粒转化抗病但不耐寒的黄瓜自交系。经Kan初步筛选、PCR检测和Southern杂交检测,确定有两株转基因植株,转化率为0.05%。不同花龄子房注射的结果表明,以花前一天子房注射效果最好,此时注射出现了转基因植株。转基因植株后代出现分离,其分离不符合孟德尔遗传规律,可能是由基因沉默所致。但随世代增加,转基因植株出现的比率明显增加。5、转基因植株抗冷性明显增强。T1代转基因植株经苗期低温胁迫发现幼苗SOD活性、POD活性比野生型显著提高,脯氨酸含量、可溶性蛋白含量比野生型大幅提高,而冷害指数明显降低,T1代转基因植株耐寒能力显著提高。T2代转基因植株经自然低温检测,发现野生型因低温死亡早。而转基因植株因低温致死时间延迟,T2代转基因植株耐寒能力优于野生型。T3代转基因植株在冬季低温条件下生长势明显优于野生型,转基因植株能安全越冬,而野生型已冻死。转基因植株抗霜雪病和白粉病能力强,具有野生型同等的抗病性,而抗冷能力明显增强,至此我们已得到了即抗病耐寒能力又大幅提高的转基因新种质,目前已得到了T3代株系,为今后开展相关黄瓜育种工作奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 黄瓜耐低温研究进展
• 1.1 低温对黄瓜的影响
• 1.2 黄瓜耐低温遗传
• 1.3 提高黄瓜耐低温胁迫的措施
• 1.4 植物对低温反应的分子机理
• 2 转录因子CBF 研究进展
• 2.1 CBF 基因克隆
• 2.2 CBF 基因的结构特征
• 2.3 CBF 基因的表达调控
• 2.4 CBF 基因抗逆作用机理
• 2.5 CBF 基因在分子改良中的作用
• 3 黄瓜转化体系研究
• 3.1 黄瓜组织培养现状
• 3.2 花粉管通道法在植物遗传转化中的应用
• 4 本研究的目的意义及技术路线
• 第二章 低温锻炼对黄瓜抗冷能力及叶片超微结构的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷能力的影响
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 试验设计
• 1.1.3 测定项目
• 1.2 低温锻炼对黄瓜幼苗叶片超微结构的影响
• 1.2.1 试验材料
• 1.2.2 试验设计
• 1.2.3 测定方法及项目
• 2 结果与分析
• 2.1 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷能力的影响
• 2.1.1 低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗冷害指数的影响
• 2.1.2 低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗电解质渗透率和丙二醛含量的影响
• 2.1.3 低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗保护酶活性的影响
• 2.1.4 低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗渗透调节物质的影响
• 2.1.5 低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗可溶性蛋白的影响
• 2.1.6 低温锻炼对黄瓜幼苗冷胁迫下 Vc 含量的影响
• 2.1.7 低温锻炼对黄瓜幼苗冷胁迫下根系活力的影响
• 2.2 低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗叶片超微结构的影响
• 2.2.1 低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗叶片叶绿体结构的影响
• 2.2.2 低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗叶片膜系统的影响
• 3 讨论
• 3.1 低温锻炼能提高冷胁迫下黄瓜幼苗的抗冷性
• 3.2 只有适宜的锻炼才能有效地增强黄瓜幼苗的抗冷能力
• 3.3 低温锻炼能改善冷胁迫下黄瓜幼苗叶片的超微结构
• 第三章 黄瓜转录因子CBF1 基因克隆及表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 酶及重要试剂
• 1.1.3 苗株及表达载体
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 黄瓜幼苗处理
• 1.2.2 黄瓜叶片总RNA 提取
• 1.2.3 cDNA 的合成
• 1.2.4 重组子的测序及序列分析
• 1.2.5 表达载体（pROK2-CBF1）的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 黄瓜叶片RNA 提取结果
• 2.2 CBF1 基因片段的 RT-PCR 扩增
• 2.3 CBF1 基因重组质粒的鉴定
• 2.4 序列分析及同源性比较
• 2.5 pROK2-CBF1 表达载体构建
• 3 讨论
• 3.1 关于供试材料和总RNA 的提取
• 3.2 关于黄瓜转录因子 CBF1 基因 cDNA 序列的高度保守性
• 第四章 CBF1 基因的遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 供试材料
• 1.1.3 酶和试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 花粉管通道途径对黄瓜的遗传转化
• 1.2.2 转基因植株的鉴定
• 1.2.3 转基因植株耐寒性鉴定
• 1.2.4 转基因植株后代分离
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因植株的鉴定
• 2.2 转基因植株耐寒能力鉴定
• 2.3 转基因植株分离
• 3 讨论
• 3.1 关于注射时间和转化率
• 3.2 关于Kan 筛选
• 3.3 关于转基因植株耐寒抗性表现
• 3.4 今后的打算
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 博士期间已发表和待发表论文