论文摘要
第一部分淋球菌多重耐药性与mtrR基因点突变的关系目的探讨多传递耐药（multiple transferable resistance,mtr）外排系统中mtrR基因点突变与淋球菌流行株多重耐药性的关系。方法应用K B法和琼脂稀释法分离出55株淋球菌流行株。利用小量细菌基因组DNA快速抽提试剂盒取淋球菌DNA,PCR扩增16株淋球菌mtrR基因,并对扩增产物测序,比较淋球菌敏感株与多重耐药株的差异。结果淋球菌多重耐药株占76.36%（42/55）。4株敏感株和2株耐青霉素淋球菌无mtrR基因突变,10株多重耐药株均有mtrR基因点突变,表现为三种点突变形式:6株发生了第45位gly（GGC→GAC）asp,3株发生了第14位his（CAC→CGC）arg,1株发生了第51位phe（TTC→GTC）val。结论淋球菌mtrR基因第45位gly（GGC→GAC）asp、14位hi s（CAC→CGC）arg和第51位phe（TTC→GTC）val突变与淋球菌流行株的多重耐药性密切相关。第二部分淋球菌主动外排泵mtrC基因原核表达系统pET mtrC的构建、鉴定和表达目的在原核表达质粒pET-28a（+）中构建淋球菌膜蛋白mtrC表达质粒,并在大肠杆菌DE3中表达相关目的蛋白,为淋球菌耐药的检测和耐药机制的研究提供基础。方法从淋球菌标准株中扩增淋球菌膜蛋白mtrC基因片段。酶切后插入pET 28a（+）,构建重组表达质粒pET-mtrC。通过质粒双酶切和DNA测序证实该重组质粒构建正确。重组质粒转化入大肠杆菌DE3中,经IPTG诱导表达蛋白。结果经酶切鉴定和测序分析,质粒构建正确,核苷酸序列与GeneBank（U14993）公布的序列相比较,同源性达到99.5%。通过IPTG诱导,SDS-PAGE可检测到约48.5kDa大小的融合蛋白,与预测分子量相同。结论淋球菌膜蛋白mtrC原核表达质粒构建和表达成功,为研究其mtr外排系统的耐药机制打下基础。第三部分淋球菌MtrC融合蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株建立和特性鉴定目的建立针对淋球菌MtrC膜蛋白的单克隆杂交瘤细胞株,制备相应的单克隆抗体,用于淋球菌耐药机制的研究和淋球菌耐药的临床检测。方法用重组mtrC免疫6周龄Balb/c小鼠,按常规淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。应用间接ELISA法和Western印迹法分别测定单抗亚类及其特异性。结果建立了2株小鼠抗mtrC单克隆抗体杂交瘤细胞283和4F7,染色体数在95～103之间,能稳定分泌抗mtrC单抗,单抗类型为IgG1,腹水效价为1:105和1:106。结论本研究建立的单抗在检测淋球菌MtrC膜蛋白时有高度特异性和敏感性。第四部分抗MtrC单克隆抗体对淋球菌CIP耐药水平的影响目的探讨用抗MtrC单克隆抗体（MtrC monoclonalantibody,MtrC Ab）干预淋球菌多传递耐药（multiple transferable resistance,mtr）系统后,mtr主动外排泵与同环丙沙星（CIP）耐药的关系。方法利用MtrC Ab、NaN:3阻断mtr主动外排泵,分别测定未加入阻断剂时和加入MtrCAb、NaN3后淋球菌对环丙沙星的吸收和积累量。结果淋球菌对CIP的吸收有一定的极限,敏感组和耐药组的吸收极限分别介于70～120ng和0～80ng之间。未加入阻断剂时,敏感组CIP积累量为93.7ng,明显高于耐药组的37.6ng（P<0.01）。加入MtrC Ab后,耐药组CIP积累量由37.6ng上升到75.3ng（P<0.05）,该水平与未加入阻断剂时敏感组比差异无统计学意义（P>0.05）。加入MtrCAb后,敏感组CIP积累量为92.3ng,与未加入阻断剂时比较无明显改变（P>0.05）。加入NaN3后,耐药组CIP积累量由37.6ng上升到77.6ng（P<0.05）,该水平与未加入阻断剂时敏感组比差异无统计学意义（P>0.05）。加入NaN2后,敏感组CIP积累量为94.8ng,与未加入阻断剂时比较无明显改变（P>0.05）。6株敏感菌均没有外排泵起作用,4株高水平耐药菌有外排泵起作用,2株低水平耐药菌没有外排泵起作用。结论淋球菌外排泵主动泵出CIP,导致菌体内CIP积累量不足,这是引起淋球菌对CIP高水平耐药的重要因素;MtrC Ab、NaN3可以阻断外排泵蛋白泵出CIP,恢复淋球菌对CIP的敏感性。第五部分外源指导序列逆转淋球菌多重耐药性研究目的研究外源指导序列（externalguide sequence,EGS）在体外逆转淋球菌临床分离多重耐药株为敏感株中的作用与能力。方法构建针对多传递耐药（multiple transferable resistance,mtr）系统中MtrC蛋白并含卡那霉素抗性基因的EGS重组质粒,常规CaCl2法将重组质粒导入临床分离多重耐药淋球菌中,通过菌落PCR鉴定,并利用分光光度计A600检测阳性转化菌在含不同浓度氨苄西林LB液体和固体培养基中的生长情况,测定淋球菌转化前后对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的最小抑菌浓度（MIC）。结果阳性转化菌PCR结果含有预期大小的转化片段;多重耐药淋球菌株在浓度为50μg/mL、100μg/mL的氨苄西林LB培养皿中均生长良好,而导入EGS-MtrC的转化菌在浓度为100μg/mL的氨苄西林LB培养液和培养皿中不能生长,在浓度为50μg/mL的氨苄西林LB培养基中生长受抑。导入EGS-MTRC的转化菌对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的MIC值均有明显下降。结论PET-28a（+）-EGS-MtrC转化淋球菌成功;导入EGS-MtrC的转化菌部分恢复了对氨苄西林的敏感性;转化菌对阿奇霉素、结晶紫、红霉素、TritonX-100、四环素的敏感性增加。第六部分Mtr系统的生物信息学分析目的采用生物信息学的方法对多传递耐药（mtr）外排系统中MtrR、MtrC、MtrD、MtrE蛋白的蛋白质理化性质、蛋白质疏水性、跨膜区、蛋白质的三维结构、蛋白质功能进行分析。方法应用Protparam工具分析蛋白质理化性质,计算相对分子质量、理论pI值、氨基酸组成、原子组成、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪系数、总平均亲水性;应用ProtScale工具分析蛋白质疏水性;应用TMpred工具分析跨膜区,预测跨膜区和跨膜方向;以同源建模方法为基础,应用SWISS-MODEL工具预测蛋白质三维结构;应用AmiGO工具对蛋白质进行功能分析。结果得到MtrR、MtrC、MtrD、MtrE反映蛋白质理化性质的相对分子质量、理论pI值、氨基酸组成、原子组成、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪系数、总平均亲水性的数值;得到MtrR、MtrC、MtrD、MtrE蛋白质疏水性分析数据;预测跨膜区MtrR无,MtrC跨膜螺旋由膜内向膜外为1个,由膜外向膜内为2个,MtrD跨膜螺旋由膜内向膜外为19个,由膜外向膜内为18个,MtrE跨膜螺旋由膜内向膜外为3个,由膜外向膜内为4个;搜寻出与MtrR、MtrC、MtrD、MtrE同源已知结构的蛋白质并预测出四种蛋白质的三维结构。MtrR的GO号为0006355,功能为转录调节因子;MtrC的GO号为0015559,具有多药外排泵的活性; MtrD的GO号为0006810,具有转运功能;mtrE的GO号为:0015562具有外排渗透酶活性。结论应用生物信息学的工具可以快速对淋球菌的目的基因进行分析,获得其功能蛋白质的蛋白质理化性质数据,对蛋白质疏水性、跨膜区、蛋白质的三维结构、蛋白质的功能进行有效的预测,对研究淋球菌的耐药系统及找到有效的干预措施有着重要的指导意义。第七部分淋球菌毒力岛的生物信息学分析目的采用生物信息学的方法对淋球菌毒力岛（pathogenicity island）中TraH、TraG、AtlA的蛋白质理化性质、蛋白质疏水性、跨膜区和蛋白质的三维结构进行分析。对淋球菌基因组和GGI岛的碱基组成进行比较分析和整合位点分析。方法应用Protparam工具分析蛋白质理化性质,计算相对分子质量、理论pI值、氨基酸组成、原子组成、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪系数、总平均亲水性;应用ProtScale工具分析蛋白质疏水性;应用TMpred工具分析跨膜区,预测跨膜区和跨膜方向;应用SWISS-MODEL工具预测蛋白质三维结构;应用IslandPath对淋球菌基因组和GGI岛的碱基组成进行比较分析;应用Islander对淋球菌基因组和GGI岛进行整合位点分析结果得到TraH、TraG、AtlA反映蛋白质理化性质的相对分子质量、理论pI值、氨基酸组成、原子组成、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪系数、总平均亲水性和蛋白质疏水性分析数值据;预测TraH跨膜螺旋由膜内向膜外为4个,由膜外向膜内为3个,TraG跨膜螺旋由膜内向膜外为8个,由膜外向膜内为8个,AtlA无跨膜螺旋;搜寻出与AtlA同源已知结构的蛋白质并预测出其三维结构;GGI岛G+C%为44%明显低于淋球菌基因组的52%;发现GGI末端带有位点特异性整合酶XerCD基因的dif位点。结论应用生物信息学的工具可以快速对淋球菌的目的基因进行分析,获得其功能蛋白质的蛋白质理化性质数据,对蛋白质疏水性、跨膜区、蛋白质的三维结构进行有效的预测和进行比较基因组学研究,对研究淋球菌的毒力岛及找到有效的干预措施有着重要的指导意义。第八部分封闭TraH基因的外源指导序列对淋球菌Ⅳ型分泌系统功能的影响目的研究外源指导序列（external gui de sequence,EGS）在体外封闭traH基因对淋球菌IV型分泌系统（typeⅣsecret ion system,T4SS）功能的影响。方法构建针对一个称为GGI（gonococcal genetic island,GGI）的新基因组岛（genomic island）中编码淋球菌Ⅳ型分泌系统的traH基因并含卡那霉素抗性基因的EGS重组质粒,常规CaCl2法将重组质粒导入淋球菌MS11株中,通过菌落PCR鉴定。用PCR方法检测淋球菌株中是否含有毒力岛。测定EGS重组质粒转化前后淋球菌生存能力和Ⅳ型分泌系统分泌DNA能力的变化。结果阳性转化菌PCR结果含有预期大小的转化片段;淋球菌MS11株中含有GGI岛,淋球菌29400、FA1090株中不含GGI岛;封闭traH基因的淋球菌t-MSll株生存能力下降;封闭traH基因的淋球菌t-MS11株Ⅳ型分泌系统的分泌功能下降。结论GGI岛存在于淋球菌MSll株中,淋球菌29400、FAl090株中不含GGI岛;PET-28a（+）EGS-traH转化淋球菌成功;导入EGS-traH的转化菌t-MS11株生存能力下降,Ⅳ型分泌系统的分泌DNA的功能下降。
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