Fe(Ⅱ)、DO含量对养殖大菱鲆幼鱼生理学性状影响的研究

论文摘要

Fe（Ⅱ）、DO含量对养殖大菱鲆幼鱼生理学性状影响的研究本文系统研究了不同浓度亚铁（Fe（Ⅱ））及溶解氧（DO）对养殖大菱鲆幼鱼生理学性状的影响。在优化海水Fe（Ⅱ）测定方法的基础上,研究了0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 mg/L等浓度的水中Fe（Ⅱ）对大菱鲆幼鱼存活、呼吸、血液学、血细胞核形态、氧化抗氧化相关酶水平及鳃组织结构的急性和慢性毒性作用。同时还研究了在极低氧（0.2、1、2mg/L）,低氧（3、5mg/L）和高氧（11、14mg/L）下,大菱鲆幼鱼存活、呼吸、酸碱平衡、血液学、核异常、氧化抗氧化相关酶水平以及鳃和肝脏组织结构的变化,结合血红素加氧酶-1（HO-1）基因表达的研究,初步分析了分子水平上低氧和高氧对大菱鲆幼鱼的影响。首先对Ferrozine法测定水中不同价态铁的方法进行了优化,建立了适用于海水水样中Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）和总铁测定的方法。并采用该方法对黄渤海沿岸部分地点、黄海海区部分站点2009年表层水样以及山东荣成湾内的天鹅湖、近岸和远海部分站点2009-2011年采集的表层水样进行了测定,此外还检测了天津、荣成及日照大菱鲆养殖场采集的水样。结果显示渤海沿岸除河北秦皇岛东山浴场及辽宁大连外,营口、秦皇岛西浴场、天津、东营支脉河口和昌邑沿岸表层水样的Fe（Ⅲ）以及总铁浓度明显高于山东省黄海沿岸,而黄渤海沿岸各水样中Fe（Ⅱ）浓度均较低且差异不明显。黄海海区各站点中,最靠近东海海区的R12、13、15三个站点水样的Fe（Ⅲ）以及总铁浓度处于较高水平,而同样靠近东海海区的R14站点水样的Fe（Ⅱ）/ Fe（Ⅲ）远高于其它各站点。荣成湾近岸和远海以及其内的天鹅湖站点水样的Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）和总铁浓度周年变化均不明显,但总铁浓度总体上为天鹅湖>近岸>远海。养殖场地下水中Fe（Ⅲ）浓度高于Fe（Ⅱ）,但一些地下水中Fe（Ⅱ）浓度仍处于较高水平。水中不同浓度Fe（Ⅱ）对大菱鲆幼鱼生理学性状影响的实验结果显示,28天实验期间内,除了2mg/L组外,Fe（Ⅱ）并未影响大菱鲆的生长,其游泳与摄食也均未出现异常。2mg/L组,在处理第1天时就观察到有鱼死亡,到第7天时该组的实验鱼全部死亡。各处理组的呼吸频率随Fe（Ⅱ）浓度的增加而上升,但在第1和第7天差异不显著;第28天时,0.1、0.5和1mg/L组显著高于对照组（P<0.05）。各组之间的血液学红细胞数（RBC）、血红蛋白（HGB）和红细胞比容积（HCT）等血液学参数无显著差异,但1mg/L组平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）在第28天时显著高于空白对照组（P<0.05）。0.1mg/L的Fe（Ⅱ）就会使大菱鲆出现微核现象,2mg/L组大菱鲆红细胞的核异常率及总核异常率显著高于其它各组（P<0.05）。第1天时,各处理组的碱性磷酸酶（AKP）活性与空白对照组及抗坏血酸对照组之间也没有显著差异,超氧化物歧化酶（SOD）活力却随着Fe（Ⅱ）浓度的增加先上升、后下降。到第28天,各组的AKP活力随Fe（Ⅱ）浓度的升高也呈现先上升后下降的趋势,SOD活力差异虽不显著,但总体上也表现出先升后降的趋势。高于0.1mg/L的水中Fe（Ⅱ）便可破坏大菱鲆鳃的组织结构,导致上皮细胞坏死,鳃小片增生等,这种破坏随Fe（Ⅱ）浓度的升高和处理时间的延长越来越严重;但较低浓度组中鳃的结构并未发生明显改变。总之,水中Fe（Ⅱ）对大菱鲆幼鱼鳃结构造成损伤,进而影响其从水中获取氧的效率,导致其呼吸频率的上升和血液学指标的代偿性变化。Fe（Ⅱ）还具有潜在的致畸变作用,可致使细胞核异常比例升高。随着Fe（Ⅱ）浓度的升高,鳃的破坏程度和核异常细胞的比率也随之升高,最终导致鱼的死亡。而0.01mg/L的Fe（Ⅱ）并不会对大菱鲆的核异常细胞率、AKP和SOD的活力以及鳃的结构造成影响,可认为是Fe（Ⅱ）的安全浓度。水中DO的对大菱鲆幼鱼生理学性状影响的实验结果表明,极低氧0.2、1和2mg/L组的实验鱼分别在处理2小时、1天和2天内全部死亡,低氧、高氧和对照组（正常充气,DO浓度约7mg/L）则没有出现死亡现象。其呼吸频率在2小时,第1天和第7天随DO浓度的上升呈现先上升后下降的趋势;到第28天,呼吸频率随DO浓度的上升而降低,停止处理14天后各组呼吸频率与对照组基本一致。各组之间的RBC、HGB和HCT等血液学参数的变化并未观察到明显的趋势,第1天时,2和3mg/L组的这3个参数值较高;恢复14天后,高氧组的这3个参数值却高于低氧组。溶解氧（DO）对大菱鲆微核及总核异常率的影响表现出明显的时间和剂量累积效应,到28天时才在5、14mg/L组和对照组中观察到微核现象;恢复14天后,高氧组和对照组中仍有微核现象出现。极低氧组血液pH值在2小时时显著低于其它各组,第1和第7天时3mg/L组pH显著高于对照组,第28天时各组pH值之间无显著差异,恢复14天后高氧组显著低于对照组（P<0.05）。各组pCO2和HCO3-浓度在2小时时随DO浓度上升先下降再上升,在第1、7和28天时则随DO浓度上升而升高,停止处理14天后各组之间差异减小。不同处理时间,各组SOD活力之间差异显著（P<0.05）,极低氧组在2小时时SOD活力较高;各组CAT活力在2小时时未发生明显变化,在7、28和42天时差异显著（P<0.05）。极低氧组大菱鲆肝脏MDA含量较低,低氧组和高氧组MDA含量随着处理时间的延长均逐渐降低。恢复后低氧组MDA含量显著升高（P<0.05）。极低氧组鳃的组织结构在整个实验期间并未发生明显变化;低氧组鳃的组织结构也未发生明显变化,仅在第28天时观察到轻微上皮细胞增生的现象;高氧组处理7天肝脏的组织结构未发生明显变化,鳃组织的部分鳃小片上出现了增生和空泡现象,到第28天,高氧组鳃的组织结构被明显破坏,鳃小片上普遍观察到增生和空泡现象;恢复14天后,各组鳃组织结构均恢复正常。极低氧组和低氧组肝脏组织结构在整个实验期间并未发生明显变化;高氧组处理到第28天时,肝脏组织结构较为疏松,恢复14天后其组织结果与对照组基本一致。实验还克隆得到了1093bp的HO-1基因cDNA序列对其氨基酸序列分析发现其中存在HO-1特征序列,在不同物种中极为保守。RT-PCR结果表明,除性腺和肾脏组织外,HO-1基因在大菱鲆各个组织中表达均较高。Real time RT-PCR结果显示,整个处理期间低氧和高氧均可导致肝脏HO-1基因表达的上调,恢复14天后各组之间HO-1基因的表达也恢复一致。由此,大菱鲆对低氧和高氧的生理响应并不相同,但低氧和高氧均可使大菱鲆受到氧化胁迫,导致核异常现象和氧化抗氧化平衡的改变。此外,正常充气条件也会使大菱鲆受到过氧化胁迫作用,因此在大菱鲆生产中DO浓度的适当降低可能会减轻大菱鲆的氧化压力,而有利于大菱鲆的健康养殖。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 铁对鱼类影响的研究进展
• 1.2.1 水中铁含量的测定方法
• 1.2.1.1 传统分光光度法
• 1.2.1.2 原子吸收法（AAS）
• 1.2.1.3 电感偶合等离子发射光谱法（ICP-AES）
• 1.2.1.4 溶出伏安法（Stripping Voltammetric）
• 1.2.1.5 化学发光法（Chemiluminescence）
• 1.2.2 铁的生物学功能
• 1.2.3 铁对鱼类的影响
• 1.2.3.1 鱼类对铁的吸收
• 1.2.3.2 对鱼类生长的影响
• 1.2.3.3 对鱼类血液学指标的影响
• 1.2.3.4 对鱼类氧化抗氧化平衡的影响
• 1.2.3.5 对鱼类免疫的影响
• 1.2.3.6 对鱼类组织结构的影响
• 1.2.3.7 对鱼类相关基因表达的影响
• 1.3 溶解氧对鱼类影响的研究进展
• 1.3.1 溶解氧的生物学功能
• 1.3.2 溶解氧对鱼类生理学性状的影响
• 1.3.2.1 对鱼类摄食与生长的影响
• 1.3.2.2 对鱼类呼吸、血液学等指标的影响
• 1.3.2.3 对鱼类抗氧化系统的影响
• 1.3.2.4 对鱼类组织结构的影响
• 1.3.2.5 对相关基因表达的影响
• 第二章 水中Fe（Ⅱ）对大菱鲆幼鱼生理学性状的影响
• 第一节 Fe（Ⅱ）测定方法的筛选与优化
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.1.1 实验试剂及配制
• 2.1.1.2 实验仪器
• 2.1.1.3 实验方法
• 2.1.1.4 亚铁、三价铁和总铁浓度计算
• 2.1.2 结果
• 2.1.3 讨论
• 第二节 黄渤海沿海部分海区水样的Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）及总铁浓度分析
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 实验试剂
• 2.2.1.2 实验仪器
• 2.2.1.3 水样的采取
• 2.2.1.4 水样测定
• 2.2.1.5 数据统计
• 2.2.2 结果
• 2.2.3 讨论
• 2.2.3.1 黄海部分海区铁含量及其对浮游植物生长的影响
• 2.2.3.2 黄海和渤海沿岸各地Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Fe（t）浓度的比较
• 2.2.3.3 荣成湾表层水样Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Fe（t）浓度的时空变化分析
• 2.2.3.4 养殖用水中铁浓度的比较
• 第三节 水中Fe（Ⅱ）对大菱鲆幼鱼生理学性状的影响
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.1.1 实验材料与培育
• 2.3.1.2 实验试剂
• 2.3.1.3 实验仪器
• 2.3.1.4 实验设计
• 2.3.1.5 呼吸频率的测定及组织样品的采取制备
• 2.3.1.6 组织切片观察、血液学参数分析、酶活力检测及核异常分析
• 2.3.1.7 数据统计
• 2.3.2 结果
• 2.3.2.1 对大菱鲆幼鱼生长与存活的影响
• 2.3.2.2 对大菱鲆幼鱼呼吸频率的影响
• 2.3.2.3 不同Fe（Ⅱ）浓度下大菱鲆幼鱼鳃组织结构的变化
• 2.3.2.4 对大菱鲆幼鱼血液学指标的影响
• 2.3.2.5 对大菱鲆幼鱼肝脏AKP、SOD 活力的影响
• 2.3.2.6 对大菱鲆幼鱼红细胞核形态的影响
• 2.3.3 讨论
• 2.3.3.1 对大菱鲆幼鱼红细胞核形态的影响
• 2.3.3.2 大菱鲆幼鱼酶活对水中不同浓度Fe（Ⅱ）的响应
• 2.3.3.3 水中高浓度Fe（Ⅱ）对大菱鲆幼鱼鳃组织结构的破坏
• 小结
• 第三章 溶解氧对大菱鲆幼鱼生理性状及相关基因表达影响的研究
• 第一节 溶解氧对大菱鲆幼鱼生理学性状影响的研究
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 实验材料
• 3.1.1.2 实验试剂
• 3.1.1.3 实验仪器
• 3.1.1.4 实验设计
• 3.1.1.5 呼吸频率的测定及组织样品的采取制备
• 3.1.1.6 组织切片观察、血液学和血气参数分析、酶活力和MDA 含量检测及核异常分析
• 3.1.1.7 数据统计
• 3.1.2 结果
• 3.1.2.1 不同浓度DO 对大菱鲆幼鱼生长、存活的影响
• 3.1.2.2 对大菱鲆幼鱼呼吸频率的影响
• 3.1.2.3 对大菱鲆幼鱼鳃及肝脏组织结构的影响
• 3.1.2.4 对大菱鲆幼鱼血液学参数的影响
• 3.1.2.5 对大菱鲆幼鱼酸碱平衡的影响
• 3.1.2.6 对大菱鲆幼鱼抗氧化酶活力以及MDA 含量的影响
• 3.1.2.7 对大菱鲆幼鱼微核及核异常的影响
• 3.1.3 讨论
• 3.1.3.1 大菱鲆幼鱼呼吸生理学指标的变化
• 3.1.3.2 大菱鲆幼鱼鳃组织结构的变化
• 3.1.3.3 低氧和高氧对大菱鲆幼鱼的氧化胁迫作用
• 第二节 水中溶解氧对大菱鲆幼鱼HO-1 基因表达影响的研究
• 3.2.1 大菱鲆HO-1 基因的克隆及其结构分析
• 3.2.1.1 材料与方法
• 3.2.1.2 结果
• 3.2.1.3 讨论
• 3.2.2 大菱鲆HO-1 基因的组织特异表达及DO 水平对其表达的影响
• 3.2.2.1 材料与方法
• 3.2.2.2 结果
• 3.2.2.3 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢