SAMP8小鼠海马异常表达miRNA的鉴定和初步功能研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病,指的是一种持续性高级神经功能活动障碍,即在没有意识障碍的状态下,记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。目前尚无特效治疗或逆转疾病进展的治疗药物。已有的证据充分表明β淀粉样肽（Aβ）在老年痴呆的发病过程中起到至关重要的起始及枢纽作用。Aβ是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）由β分泌酶和γ分泌酶水解产生,故高表达的APP与AD的病理机制直接相关。事实上21号染色体上APP的基因多拷贝以及APP启动子的多态性是导致AD发生的重要因素,因此研究APP的表达调控机制有助于我们理解老年痴呆的发病机制。有研究发现,miRNA在神经退行性疾病中表达异常,提示其可能在神经退行性疾病的发生发展过程中发挥重要的作用。我们选用了AD的动物模型--快速老化痴呆模型小鼠（senescence accelerated mouse, SAM）开展了AD发病机制的研究。SAMP8是SAMP系中的一个亚系,主要以学习记忆能力障碍为老化特征,其寿命约为18.9个月,是目前公认的比较理想的快速衰老痴呆模型,SAMR1表现为正常衰老,一般作为SAMP8的正常对照。我们首先利用水迷宫,避暗实验从行为学证实了模型的可靠性,结果显示不同月龄的SAMP8（4月、8月、12月）学习记忆能力均明显低于相应月龄的SAMR1,然后从蛋白水平检测APP的表达,发现SAMP8的APP蛋白表达水平均显著高于SAMR1,并且其APP的mRNA水平对比增高不如蛋白变化明显,提示存在着APP蛋白表达水平的一个转录后调控机制。基于以上结果提示APP蛋白表达可能受miRNA调控,结合生物信息学和生物学实验寻找可能作用于APP的miRNA:首先我们利用TargetScan对APP的3’端非编码区（3’UTR）可能结合的miRNA进行了生物信息学分析,同时利用miRNA chip实验检测SAMP8和SAMR1海马中表达差异的miRNA,并用Real-time PCR验证了部分miRNAs的表达。依据APP蛋白表达水平在SAMP8中较SAMR1升高的趋势,故选择在SAMP8中表达降低的miRNA,即miRNA-16、miRNA-144、miRNA-195、miRNA-383,进行了后续的荧光素酶活性分析及蛋白水平验证,结果表明miRNA-16生物学效应最为显著。利用miRanda软件对APP 3’ UTR中的miR-16结合位点进行分析,并在不同物种中比较了结合位点序列的保守性,随后进行了结合位点缺失的荧光素酶活性分析。同时在小鼠脑神经瘤细胞（Neuro-2a）和小鼠成纤维细胞（NIH 3T3）这两个细胞系过表达miR-16, APP蛋白表达降低,结果证实APP 3’ UTR中带有miR-16结合位点,受到miR-16的调控。为了进一步验证miR-16在SAM小鼠海马中对内源性APP的调控作用,我们首先利用原位杂交和免疫组织化学的方法检测了SAM小鼠海马中miR-16和APP的的表达。结果发现,APP蛋白与miR-16在海马中的表达水平呈负相关,并且分布具有互补性。miR-16在海马锥体细胞层、颗粒细胞层表达较强,而APP则在海马其他区域表达较强。随后我们采用脑立体定位仪将miR-16的模拟物和对照注射入SAMP8小鼠侧脑室,Western Blot结果显示APP表达水平模拟物组较对照组明显下调,而RT-PCR结果显示mRNA不发生明显的变化。在正常小鼠胚胎神经系统发育过程中APP是否也受miR-16的调控作用呢,我们通过miR-16的原位杂交和APP的免疫组织化学染色在小鼠胚胎12.5天、16.5天组织切片中证实,miR-16主要表达在室周,即前体细胞,APP主要表达在外周,即成熟神经元,二者的分布基本互补。综合以上研究结果,我们初步证明：在AD的动物模型SAMP8小鼠中,异常低表达的miR-16在转录后水平减弱了对其靶基因APP表达的抑制,导致SAMP8中APP较SAMRl表达显著增高,是其学习记忆能力降低的可能原因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 不足和展望
• 参考文献
• 论文综述
• 附录
• 个人简历
• 致谢