Phellinus sp. SYBC-L2固态发酵产漆酶条件的优化及其酶学性质的研究

论文摘要

漆酶（Laccase,EC 1.10.3.2）是一种含多个铜原子的多酚氧化酶,催化氧化多种芳香族化合物,具有降解木质素和使苯氧基类除草剂等有毒酚类物质无毒化的作用,还可以去除石油工业废水的毒性。近年来在造纸、饮料加工、环保等方面得到广泛的应用。因此,研究其漆酶的分离纯化、酶学性质具有一定的理论和现实意义。本研究利用平板筛选法,从江南大学青山湾校区的香樟树上采集的样品中分离得到一株产漆酶活力较高的真菌,经形态学初步鉴定,确定该菌为木层孔菌属,命名为Phellinus sp. SYBC-L2。对菌株Phellinus sp. SYBC-L2产漆酶的固态发酵培养基和发酵条件进行了研究。最适固态发酵培养基组成为（w/w）:豆粕与木屑1︰1的比例混合,木糖0.5%,酒石酸铵2.0%,CuSO4 0.04%,CaCl2 0.48%,KH2PO4 0.5%,MgSO4·7H2O 0.5%,培养基的含水量为65%。适宜的固态发酵条件:250 mL三角瓶中装50 g固体培养基,厚度约为4.5 cm,培养基初始pH为7.0,在培养基中添加单宁酸终浓度为10μmol/L,培养温度为30℃,培养时间为9 d。固态发酵培养基和培养条件优化后,菌株Phellinus sp. SYBC-L2产漆酶酶活达到21.462 U/g湿曲,比优化前（1.914 U/g湿曲）提高了约10倍。菌株Phellinus sp. SYBC-L2固态发酵所产的漆酶通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析三步分离纯化后,得到电泳纯的漆酶,纯化倍数为28.27,回收率为14.76%,其分子量约为64.3 KDa,分子构型为单体或同源寡聚体。以DMP（2,6-二甲氧基酚）为底物时,测定该酶的米氏常数Km值为1.18 mmol/L,最大反应速度Vmax为15.95 U/mg蛋白。纯化后的漆酶最适温度为60℃,在50℃保温1 h仍能保持80%以上的活力,温度稳定性较好;最适pH为3.5,pH稳定性范围广,在pH 6.08.5的范围内于30℃保温24 h仍能保持在80%以上的活力;SO42-、CO32-、Cu2+对漆酶酶活有促进作用,Cl-、Fe3+、Fe2+对漆酶酶活有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 漆酶
• 1.1.1 漆酶的结构及催化机理
• 1.1.2 漆酶的作用底物
• 1.1.3 漆酶的分子生物学研究
• 1.1.4 漆酶活力的测定方法
• 1.1.5 漆酶的酶学性质
• 1.1.6 漆酶的应用
• 1.2 白腐真菌的研究
• 1.2.1 白腐真菌的分类及来源
• 1.2.2 白腐菌降解芳香化合物的机制及其优势
• 1.2.3 白腐真菌研究和利用现状
• 1.2.4 白腐真菌发展趋势
• 1.3 固态发酵
• 1.3.1 固态发酵简介
• 1.3.2 漆酶的固态发酵
• 1.4 论文的主要研究内容
• 第二章 产漆酶真菌的分离筛选及其初步鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 试剂与仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 产漆酶真菌的筛选
• 2.2.6 漆酶酶活的测定
• 2.2.7 蛋白质测定方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 产漆酶真菌的筛选
• 2.3.2 菌株SYBC-L2 的初步鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 PHELLINUS SP. SYBC-L2 固态发酵产漆酶培养基的优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 试剂与仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 固态发酵及胞外漆酶的提取
• 3.2.5 漆酶酶活的测定
• 3.2.6 蛋白质测定方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 菌株Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产酶曲线
• 3.3.2 不同溶液对Phellinus sp. SYBC-L2 漆酶提取的影响
• 3.3.3 醋酸-醋酸钠缓冲液pH 对漆酶提取的影响
• 3.3.4 醋酸-醋酸钠缓冲液浓度对漆酶提取的影响
• 3.3.5 不同固体物质对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.6 豆粕和木屑比例对Phellinus sp.SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.7 培养基含水量对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.8 碳源对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.9 木糖浓度对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.10 氮源对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.11 酒石酸铵浓度对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.12 Cu2+浓度对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.13 正交实验
• 3.3.14 物料厚度对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.15 培养基初始pH 对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.16 不同化合物对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.17 培养温度对Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产漆酶的影响
• 3.3.18 发酵条件优化后Phellinus sp. SYBC-L2 固态发酵产酶曲线
• 3.4 讨论
• 第四章 PHELLINUS SP. SYBC-L2 漆酶的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 技术路线
• 4.3 材料与方法
• 4.3.1 实验材料
• 4.3.2 试剂与仪器
• 4.3.3 硫酸铵分级沉淀条件的确定
• 4.3.4 DEAE-纤维素离子交换柱层析
• 4.3.5 SephacrylTMS-200 柱层析
• 4.3.6 漆酶酶活测定方法
• 4.3.7 蛋白质测定方法
• 4.3.8 蛋白电泳
• 4.3.9 纯化倍数与回收率的计算
• 4.4 结果
• 4.4.1 硫酸铵分级沉淀
• 4.4.2 DEAE-纤维素离子交换柱层析
• TMS-200 柱层析'>4.4.3 Sephacryl^TMS-200 柱层析
• 4.4.4 laccase 纯化结果分析
• 4.4.5 电泳结果验证
• 4.5 讨论
• 第五章 PHELLINUS SP. SYBC-L2 漆酶的酶学性质研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 试剂与仪器
• 5.2.3 漆酶酶活测定方法
• 5.2.4 温度对漆酶的影响
• 5.2.5 pH 对漆酶的影响
• 5.2.6 无机离子对漆酶的影响
• 5.2.7 漆酶的动力学研究
• 5.3 结果
• 5.3.1 漆酶的分子特征
• 5.3.2 漆酶的最适温度
• 5.3.3 温度对漆酶稳定性的影响
• 5.3.4 漆酶的最适pH
• 5.3.5 pH 对漆酶稳定性的影响
• 5.3.6 无机离子对漆酶酶活的影响
• 5.3.7 漆酶的反应动力学参数
• 5.4 讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文