树突状细胞分化成熟的表观遗传组学研究

论文摘要

树突状细胞（Dendritic cell,DC）于1973年被Steiman和Cohn首次从脾脏中分离出来,随后的一系列研究发现其在免疫识别、免疫应答和免疫调控中发挥着重要作用,因此,有关DC的免疫生物学基础研究及其与临床疾病发生发展和治疗的应用性研究是当今免疫学领域的前沿热点。DC来源于造血干细胞,其在免疫应答的首要环节——抗原识别与提呈中扮演着重要的角色。免疫系统中的DC主要存在两种功能状态:未成熟DC（immature DC,imDC）和成熟DC（mature DC, mDC）,不同的成熟状态决定了DC不同的功能特性,imDC具有很强的摄取和加工抗原的能力,并能够通过其表面的趋化因子受体,通过血液和淋巴系统迁移入淋巴结和脾;imDC在摄取抗原和炎症信号的刺激下转变为mDC,mDC抗原提呈能力明显增强,高表达共刺激分子和T细胞区的趋化因子受体,并分泌大量的细胞因子,激活T细胞,触发T细胞的增殖和分化。同时其分泌的炎性细胞因子和趋化因子能够吸引和活化天然免疫细胞以形成免疫应答与调控的网络。DC作为免疫系统中功能最强大的专职抗原提呈细胞（Antigen-presenting cells, APC）,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁,有关DC分化发育、功能调控机制的研究仍然有问题尚不明了,DC与疾病发生发展关系与治疗的应用研究也有待于进一步深入探讨与验证。作为独立于基因组序列本身,以整个染色质组成及其动态调控为研究对象的表观遗传学（Epigenetics）成为了21世纪极为重要的生命学科之一。经历从1842年至今的巨大发展,表观遗传学逐渐走向成熟,形成了以DNA甲基化、组蛋白修饰、能量依赖的染色质重塑、核小体的动态重组以及非编码RNA研究为核心的主流生命科学学科。各种表观遗传学事件在不同层次的相互作用和整合,建立和维持了不同的基因表达模式,严格的控制着从受精卵到完整生命体的分化发育全过程,成熟体各种细胞表型的维持以及与外界环境相互作用所产生的应答和反应,从而在机体的整个生理条件下发挥着至关重要的调控作用。在组学背景下,利用芯片以及第二代测序技术,在全基因组水平系统全面的研究表观遗传修饰图谱的表观遗传组学（Epigenome）也应运而生。系统、综合地在全基因组水平上绘制细胞乃至各实体分化,发育的动态DNA甲基化谱、组蛋白修饰谱、non-coding RNA组,已经成为系统深入地研究生命发生本质和疾病发生发展的重要手段。近十年来,免疫学研究的发展突飞猛进,基础免疫学、临床免疫学和免疫学技术三大方面齐头并进,同时免疫学与其他生命科学和医学学科的交叉更加深入和广泛,在组学时代的宏观背景下,免疫组学也逐渐形成。同时伴随着功能基因组学时代的浪潮,免疫组学与各种组学研究也开始相互融合,越来越多的免疫学家开始把各种组学研究运用到免疫模型中去解决免疫学的根本性科学问题。表观遗传组学也开始应用到免疫细胞分化发育,以及免疫相关疾病和血液肿瘤的研究中。T细胞、B细胞的全基因组DNA甲基化谱已经开始利用低分辨率的技术手段进行绘制,与此同时,通过染色质免疫共沉淀结合测序（ChIP-sequencing）绘制全基因组组蛋白修饰谱,也应用到免疫学研究中,国外几个实验室开展了CD4+T细胞分化过程中（naive, Th1, Th2,Th17, iTreg, and natural Treg （nTreg） cell）的组蛋白修饰谱研究,并结合基因表达谱来找寻组蛋白修饰在调控不同类型基因中的共同规律。关于DC分化、成熟及其功能的表观遗传调控研究才起步,大多数研究尚集中在对一些DC的功能性细胞因子产生的调控,如组蛋白甲基化修饰对IL-12的调控,以及HDAC11对IL-10的负调控作用等等,同时抗原提呈关键分子MHC II类分子及其调控因子CIITA在DC成熟和活化中也受到表观因子的调控,但目前尚没有从DC的分化和特异功能的角度来探讨表观修饰因子调控DC的标志性研究。表观遗传学通过对染色质状态的调控,控制着细胞特异性基因群体在特定的时间和空间的开启与关闭。特定的细胞群体,在外界信号的作用下,或者在分化发育过程中,建立起自身独特性的DNA甲基化谱、组蛋白修饰谱以及非编码RNA组,通过这些表观调控因子在全基因组范围内的整合和相互作用,建立起组织和细胞特异性的表观遗传组,而反过来表观遗传组又能够建立细胞特异性的转录组,从而使特定细胞群体获得其特异的功能状态,从而建立了out-in-out的调控模式,决定了细胞的分化发育命运。从表观遗传学的观点,单一的细胞群体,特别是人的原代细胞的特异性表观遗传组图谱,会具有怎样的典型特征呢? DNA甲基化谱、组蛋白修饰组、非编码RNA组以及染色质重塑复合体,在人的原代细胞的分化发育过程中,又是如何相互作用和相互影响,在DNA、组蛋白以及与其相结合的RNA和蛋白质的各个层次和三维空间中,建立起细胞特有的表观遗传组的呢?从特定免疫细胞群体,如树突状细胞（DC）等出发,哺乳动物,特别是人的血液系统和免疫器官中特定原代免疫细胞,在特定的信号,如细胞因子作用和感染刺激的诱导下,是如何通过外界信号的传递,从胞外-胞膜-胞浆-胞核,由外而内的传递DC分化成熟信号,通过外界信号活化和诱导的转录因子,非编码RNA等建立起信号特异性的动态的特征性表观遗传组?再从胞核-胞浆-胞膜-胞外,由内而外的,通过表观遗传因子的特异性调控,决定关键基因的开启与关闭,从而建立起未成熟DC（imDC）、成熟DC（mDC）的特异性功能特征,如抗原摄取、加工、提呈能力的差异性调控,DC特异性细胞因子和抗菌分子的分泌?基于以上研究进展和现状分析,针对以上科学问题的思考,我们利用深度测序技术,以表观遗传组学为研究手段,深入研究了人单核细胞,以及由其体外分化而来的人未成熟DC与成熟DC的动态的、以单个核苷酸为分辨率的全基因组DNA甲基化谱、组蛋白修饰谱、表达谱以及小RNA组,系统阐述了新鲜分离纯化的人免疫细胞群体的特征性表观遗传组,以及各表观调控因子之间的相互关系,并通过寻找DC分化成熟过程中的差异表观修饰位点,来进一步揭示炎症信号如何通过由外到内的传递,特异性的介导表观修饰的改变,而又通过这些表观修饰来影响关键基因,如转录因子的表达,从而使DC具备了其特异性的功能状态,由此建立了特异性信号诱导——差异表观修饰位点——关键基因表达改变的研究思路,为寻找调控DC分化发育的关键分子,特别是核内的调控因子奠定了实验基础。同时,考虑到专职定位于核内的小RNA的研究目前尚是空白,我们通过小鼠成熟DC（mDC）胞浆、胞核小RNA组的建立,从另一个表观遗传调控因子——非编码小RNA的视角,来寻找和研究细胞核内的调控性小RNA的分布和序列特征,并结合DC的功能特点,初步探讨了这些核内小RNA是如何特异性地靶向关键基因的调控区域,来介导表观修饰的改变,从而控制DC特异功能基因的开启和关闭的。一.人单核细胞及树突状细胞分化成熟的动态表观遗传组学图谱的建立和表观调控机制的初步研究为了应用表观遗传组学的技术手段来分析人DC分化成熟的表观调控机制,我们分离了单个正常人的CD14+单核细胞,并体外诱导分化为imDCs,并进一步用LPS刺激imDCs,诱导其成为mDCs。提取这三种细胞的DNA、RNA以及以组蛋白修饰为研究对象,进行ChIP实验,获得ChIP-DNA,将所得产物进行DNA甲基化谱测序、表达谱测序、小RNA组测序、ChIP-seq,建立了三种细胞的以单个核苷酸为分辨率的DNA甲基化谱、组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3的全基因组修饰谱、基因表达差异的表达谱、小RNA表达差异的小RNA组,将这些数据进行整合研究,发现三种细胞中全基因组DNA甲基化主要以CG为背景的C的甲基化为主,占99%以上,同时三种细胞的甲基化率均一性较强,80%以上的以CG为背景的甲基化的C（mCG）的甲基化率均在90%以上,同时在monocyte分化为imDC的过程中,发生了广泛的DNA去甲基化。组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3在全基因组的分布分析显示,二者在基因的CDS区较少富集,同时我们发现H3K4me3和H3K27me3共修饰的区域其DNA甲基化率明显低于H3K4me3和H3K27me3单独富集的区域,在单核细胞中尤为明显。这可能也反映了H3K4me3和H3K27me3共修饰的区域,通过DNA的低甲基化保持了可诱导活化或抑制的调控潜能。通过进一步分析基因组各元件的DNA甲基化特征,我们发现CG的密度与甲基化率存在负相关,CG高密度区的DNA甲基化率较低。同时不同的基因组元件也有其各自的DNA甲基化分布模式。单细胞分析基因表达量与DNA甲基化和组蛋白修饰的关系,我们发现高表达的基因其启动子区的DNA甲基化率较低,但在其转录区,特别是第一个intron之后的转录区,其DNA甲基化与基因表达是正相关的。而远端的启动子区,也能观察到DNA甲基化与表达量的正相关关系。而microRNA表达丰度与DNA甲基化的关系,却有不同,microRNA转录区的DNA甲基化是明显地高甲基化对应低表达,这说明了microRNA和蛋白编码基因的DNA甲基化调控模式是不同的。同时组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3主要集中在TSS附近,H3K4me3富集于高表达基因,而H3K27me3富集于低表达基因,说明了二者对于基因表达的不同调控作用。我们进一步分析了基因表达和表观修饰在三种细胞中的动态变化特征,基因表达的雷达图分析表明,DC分化成熟时,伴随着广泛的基因表达变化,说明了三种细胞不同的功能状态,从蛋白编码基因表达变化图中可以看出,在monocyte-imDC-mDC分化成熟过程中,先升高后降低的变化基因较少,也说明了DC和单核细胞在基因表达和功能上的异质性。而microRNA的表达差异分析表明,表达量显著降低的microRNA较多,也反映了单核细胞分化为DC的过程中,通过下调microRNA来解除对一些基因表达的抑制,从而获得更多的功能。PCA分析表明,DNA甲基化相对于组蛋白修饰和microRNA,在三种细胞中是比较稳定的。通过DC功能相关pathways的基因启动子区的DNA甲基化分析表明,这些pathways中大多数基因在单核细胞分化为imDC时发生了DNA的去甲基化,为这些基因的高表达或后期的激活做好准备。通过DNA甲基化和组蛋白修饰以及microRNA的聚类分析发现,DNA甲基化和组蛋白H3K27me3的动态变化呈现相同的变化趋势,特别是对于H3K27me3高富集的区域,说明了二者的共调控关系。DNA甲基化在单核细胞分化为imDC的过程中略微降低,但在imDC成熟时,DNA甲基化从整体水平上看较为稳定,那么DNA甲基化是如何参与调控DC成熟的呢?我们通过寻找imDC-mDC的差异甲基化区域（differential methylated regions, DMRs）,发现DNA甲基化能够调控一些转录因子。众所周知,转录因子对于细胞的分化和功能状态的调控是极其重要的。我们发现转录因子FLI1、HSF4和EGR1启动子的特定区域,在DC成熟时,经历了DNA甲基化水平的升高,而其表达却显著降低。我们进而以EGR1为研究对象,探讨了EGR1在DC分化成熟中的功能,通过EGR1的ChIP-seq数据分析,发现EGR1在imDC中倾向于调控细胞表面分子的表达,通过慢病毒介导的gain-and-loss研究,发现EGR1能够抑制CD86,CD48,CD58的表达,从而抑制DC的成熟,可见,为了促进CD86,CD48,CD58的表达而使DC更好地激活T细胞,促DC成熟信号可以通过调控DNA甲基化而抑制了EGR1的表达,从而促进了DC成熟及其T细胞激活功能。二.小鼠成熟树突状细胞（mDC）核内小RNA组的建立、特征分析以及初步功能探讨随着非编码RNA研究的深入,非编码小RNA的存在及功能越来越受到关注。siRNA作为植物中存在的内源性小RNA,能够以全序列匹配的方式介导靶mRNA的降解,microRNA作为一种更加广泛存在于动植物中的非编码小RNA,以部分序列匹配的方式参与细胞内mRNA的降解和翻译的抑制。siRNA在植物中能够介导基因转录水平的表观调控,如介导基因启动子区的DNA甲基化的修饰,但哺乳动物中现今并没有找到一类介导表观调控的小RNA,基于此,我们以小鼠mDC为细胞模型来寻找哺乳动物中是否存在一类主要定位于核内,专职介导基因转录的表观调控的小RNA。我们分离mDC的胞浆、胞核两个组分的RNA,进行小RNA测序研究,发现细胞核内的小RNA组的组分和特征有别于胞浆小RNA组,来源于重复序列,核小RNA（snRNA）和核仁小RNA（snoRNA）的小RNA主要定位于核内,而microRNA则主要定位在细胞浆中,同时核内的小RNA的长度分布也并不类似于胞浆中以22nt为主的分布,富集于核内的小RNA的5`端以A、T为主,3`端为C的比例较低,而在20-23nt的small RNAs中,较多以G结尾。我们将主要富集于核内的小RNA命名为nlsRNA（nulear localized small RNA）,这类RNA产生部分依赖于Dicer酶的加工,但他们都不与AGO家族的蛋白相结合。基于这类nlsRNA可能通过与启动子部分匹配的模式来介导基因转录的表观调控,我们分析了Dicer不依赖的nlsRNAs中表达量最高的一个nlsRNA,即nlsR-3的seed sequence与小鼠基因启动子区的互补位点,发现nlsR-3能够特异性靶向小鼠iNOS启动子区的关键调控区域,同时通过其模拟物过表达和抑制物干扰等手段,发现其能够抑制LPS诱导的iNOS的转录。进一步研究其对iNOS表达的调控机制,发现nlsR-3能够介导染色质重塑抑制蛋白Mi-2β特异性靶向iNOS的启动子区,抑制iNOS的表达,同时能够增加抑制性组蛋白修饰H3K27me3在iNOS启动子区的产生来抑制iNOS的表达,并通过二者维持细胞静息状态下iNOS启动子区的染色质关闭状态。综上所述,我们通过大规模测序建立了人DC分化成熟的DNA甲基化谱、组蛋白修饰谱、mRNA表达谱和小RNA组,以及小鼠mDC的核小RNA组,以表观遗传组学的角度从面、线、点较深入地研究了表观调控因子如何通过特异性调控DC功能相关的关键分子的表达来调控DC的分化成熟。我们系统分析了人DC分化成熟过程中的差异表观修饰位点和差异表达基因,发现了DC成熟过程中受DNA甲基化调控的关键转录因子。通过核质分离小鼠mDC的小RNA,并结合高通量测序,我们发现了一群新的定位于核内的小RNA,并初步探讨了其介导表观修饰酶特异性靶向DC功能相关基因的启动子区,调控基因转录的新机制。大量组学数据的获得,为关于DC的表观调控研究提供了特异性信息分析数据平台,也为在染色质水平干预DC功能,以及以表观调控为视角来提高DC疫苗效率、设计新的免疫治疗调控靶点和药物靶标提供了线索和新的研究方向。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分人单核细胞及其分化来源的树突状细胞表观遗传组学的建立和研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二部分小鼠成熟树突状细胞核内小 RNA 组的建立与功能研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述表观遗传组学在免疫学研究中的应用及进展
• 参考文献
• 在读期间参加的科研工作情况
• 致谢