论文摘要
前列腺癌（prostate cancer, PCa）作为男性恶性肿瘤,在我国的发病率较欧美国家低,但随着人口老龄化发展,其发病率迅速上升,且中晚期患者的比例远远大于国外,恶性程度高、死亡率高,已成为危害中老年男性健康的恶性疾病。PCa作为激素依赖性肿瘤,其细胞增殖主要受雄激素/雄激素受体（Androgen receptor, AR）介导的信号途径调节,因此内分泌治疗是中晚期前列腺癌的首选方法,但几乎所有初始对内分泌治疗敏感的前列腺癌患者最终都将产生激素抵抗,发展为激素难治性前列腺癌（Hormone refractory prostate cancer, HRPC）,对抗内分泌治疗,约80%患者伴有骨或软组织转移,抗凋亡,抗药性强,死亡率高。尽管对HRPC的病理机制有相当深入的研究,但其复杂性使其治疗困难,目前化疗仍是有效的治疗手段。以天然药物紫杉醇（Paclitaxel or Taxol, Tax）为基础的全身化疗尤为引人注目,因其是唯一被证实可延长HRPC患者生存期的药物。但大约有50%的晚期前列腺癌患者对多西紫杉醇治疗不敏感,甚至产生明显的毒性反应和多药耐药（multidrug resistance, MDR）性。因此,深入研究HRPC的药物耐受机制、寻找治疗HRPC的新药物一直备受关注,而以天然产物为基础的新药研究具有独特的优势。我们利用激素非依赖性前列腺癌PC3细胞构建紫杉醇耐药细胞株PC3/Tax,对其耐药表型、基本生物学特性进行分析检测。由于泛素—蛋白酶体（ubiquitin-proteasome system, UPS）是产生MDR的机制之一,而结构新颖的联苄化合物Riccardin D （RD）对前列腺癌、特别是对激素非依赖性前列腺癌细胞有很好的抑制作用,动物实验呈现良好的抗肿瘤活性,并已证实具有抑制蛋白酶体活性,因此我们对Riccardin D是否具有逆转MDR活性进行了初步探讨。目的：建立激素难治性前列腺癌紫杉醇耐药细胞系PC3/Tax,分析其耐药性、基本生物学特性,并初步探讨小分子天然产物Riccardin D对耐药细胞PC3/Tax的作用。方法：以紫杉醇敏感的、激素非依赖性前列腺癌细胞PC3为亲本细胞,采用间歇逐步增加紫杉醇剂量的方法,建立前列腺癌耐药细胞系PC3/Tax。利用光镜、电镜观察、MTT法、流式细胞技术、定量PCR、Western blot及基因表达差异谱分析等方法,检测耐药细胞PC3/Tax与其敏感细胞PC3相比,在细胞形态、亚细胞器变化、对常用化疗药物的应答情况、细胞的生长曲线及倍增时间变化、细胞周期变化；分析周期相关、凋亡相关、增殖相关基因等的表达情况；并检测经典耐药蛋白P-gp的表达情况以及联苄化合物RiccardinD对PC3/Tax增殖的影响。结果：第一部分紫杉醇耐受前列腺癌细胞株PC3/Tax的表型分析1、具有多药耐药特性：与敏感细胞PC3相比,PC3/Tax对紫杉醇的半数致死浓度（IC50）提高了56倍,并对化疗药物长春新碱、阿霉素产生不同程度的交叉耐药性,其耐药倍数分别为60.42和40.24,但对顺铂无明显的交叉耐药性（耐药倍数为1.63）,表明PC3/Tax具有多药耐药特性。2、形态学变化显著：与敏感细胞相比,PC3/Tax细胞形态变化明显,细胞呈细长、形态不规则。电镜结果显示,胞质中内质网肿胀；高尔基复合体明显、且伴有囊腔肿胀；线粒体基质密度增高,自嗜体、脂质泡明显增多。3、细胞增殖略有下降：耐药细胞增殖速率有所减慢,其细胞倍增时间由敏感细胞的1.93天延长至2.46天。G1期细胞有所增加,而S期细胞有所减少。Western blot、定量PCR及芯片数据显示,与敏感细胞相比,G1/S周期相关的Cyclin D1、A的表达在耐药细胞中均无显著变化,而Cdc25A的表达略有上调。由于PI3K/Akt/NF-к B信号通路在PC3细胞中持续活化且与其细胞增殖密切相关,在耐药细胞株中Akt和p65（NF-к B的亚基之一）表达并无改变,但磷酸化Akt和p65的表达下调。结果表明,耐药细胞的增殖能力有所降低。4、跨膜转运蛋白表达各异：耐药经典基因mdrl勺mRNA在敏感细胞与耐药细胞均有表达,且在耐药细胞中的表达显著增加；但流式结果显示,mdrl的蛋白产物药泵蛋白P-gp在敏感细胞与耐药细胞中均不表达。另外,芯片结果显示,在耐药细胞中,其它跨膜转运基因如ABCC1/MRP1的表达无变化,而ABCC2/MRP2, ABCC3/MRP3和ABCC10/MRP7呈上调趋势,其中ABCC10/MRP7已有文献报道与紫杉醇耐药相关,因此,药泵蛋白P-gp可能不参与其耐药过程,而MRP7可能发挥药物外排泵的作用,其作用有待研究。5、其它耐药相关基因：芯片分析结果显示,glutathione S-transferase pi （GST-pi）, Topoisomerase Ⅱ-alpha （TOPO-2α）, thioredoxin reductase3,抗凋亡蛋白Bc12以及微管蛋白alpha8、微管蛋白beta6等在耐药细胞中高表达,分别上调6.9,7.4,13.9,14.9,2.8和8.0倍。结论：人前列腺癌多药耐药细胞系PC3/Tax中多种耐药相关基因（抗凋亡基因、药物外排泵基因、药物代谢基因、微管相关基因等）在耐药细胞中表达升高,可能与其耐药有关；而P-gp耐药糖蛋白在耐药细胞中不表达,可能不参与其耐药过程,其耐药机制有待进一步研究。第二部分新型蛋白酶体抑制剂片叶苔素D对耐药细胞的作用1、片叶苔素D显著抑制敏感细胞PC3、耐药细胞PC3/Tax的增殖：MTT结果显示,细胞经片叶苔素D处理24h后,其对PC3、PC3/Tax细胞的IC50分别为14.0±1.2、12.1±0.89。结果表明,片叶苔素D对耐药细胞的增殖具有显著的抑制作用。2、片叶苔素D不增加耐药细胞对紫杉醇的敏感性：片叶苔素D不能够逆转紫杉醇介导的多药耐药,当它们和紫杉醇联用时,紫杉醇的IC5。没有明显变化。3、片叶苔素D对药物蓄积的影响：通过Rh123蓄积实验,结果显示片叶苔素D可增加耐药PC3/Tax细胞中Rh123的蓄积,但药泵通用抑制剂维拉帕米处理后罗丹明的蓄积程度非常显著,远高于片叶苔素D处理组。对耐药细胞药物此结果提示我们,片叶苔素D可能对跨膜转运蛋白具有一定的抑制作用。进一步检测分析显示,片叶苔素D对P-gp药泵蛋白高表达的KB/VCR细胞中罗丹明的蓄积没有影响,表明片叶苔素D可能对其它跨膜转运蛋白有一定的抑制作用,需进一步研究。4、片叶苔素D对荷瘤小鼠具有显著的抗肿瘤活性：由PC3细胞建立的异种移植瘤小鼠经片叶苔素D给药处理后,小鼠体重并无明显变化,但瘤体积、瘤重均显著减少。蛋白印迹结果显示,片叶苔素D显著下调抗凋亡基因Bcl2的表达、增加凋亡蛋白BAX的表达,呈现良好的抗肿瘤活性。结论：片叶苔素D显著抑制耐药细胞的增殖,对药物外排泵有一定的抑制的作用。对荷瘤鼠具有良好的抗肿瘤活性,但对耐药鼠的抗肿瘤活性、逆转耐药活性有待研究。