碱基切除修复基因MUTYH与结直肠癌的易感性的相关研究

论文摘要

前言DNA氧化损伤是生物体内基因突变的常见原因之一,在人类中活性氧簇对DNA损伤大约每天每个细胞104次。ROS可以是细胞新陈代谢的产物,也可因外源性的物理或化学的氧化作用而产生,一旦其超过生物体内的抗氧化系统所承载的极限,累积的ROS便可攻击DNA,造成核内和线粒体DNA的损伤,如碱基错配、修饰、脱嘌呤或脱嘧啶位点的形成、DNA断裂以及DNA蛋白质交联等。ROS也是某些退行性疾病如老化、癌症、免疫系统功能下降、神经退行性变、白内障等发生的原因。DNA氧化损伤产物主要有8-氧-脱氧鸟苷和2-羟基腺苷,其中8-氧-脱氧鸟苷最稳定,是最重要的产物。在细菌和酵母体内,8-氧-脱氧鸟苷引起DNA损伤的机制可以是模板链中鸟嘌呤的直接氧化,也可以是核苷酸池中游离鸟苷的氧化,DNA聚合酶与8-oxodG:A中腺嘌呤的结合效率比胞嘧啶高5到200倍。因此,如果8-oxodG:C不能得到及时修复,在复制中8-oxodG易与A错配,继续复制在子链中形成A:T配对,最终导致G:C→A:T的碱基颠换,从而引起相关基因功能的改变,促进肿瘤的发生。碱基切除修复途径在生物体内是保守的,在参与修复氧化损伤所引起的突变中起到至关重要的作用。其中NUDT1基因定位于染色体7p22,其蛋白质发挥作用的时间在DNA复制之前,它水解核酸池中氧化的三磷酸鸟苷,阻止其进入复制过程。OGG1基因定位于染色体3p26.2,其蛋白质在复制过程中识别并切除8-oxodG:C中的8-oxodG,启动复制中的BER系统,MUTYH基因定位于染色体1p32.1至p34.3,MUTYH基因编码一种特异的腺嘌呤转葡糖基酶,在复制后切除子链DNA中与母链8-oxodG错配的A。如果MUTYH蛋白失活,则易导致复制过程中G:C→A:T的颠换。研究表明在癌基因及抑癌基因中,由于碱基切除修复途径缺陷所引起的基因突变频率的增加能导致肿瘤发生。事实上,以前报道的在多发性结直肠腺瘤性息肉病和结直肠癌中腺瘤性结直肠息肉病基因高频率体细胞G:C→A:T的突变均与MUTYH双等位基因的胚系突变有关。此类疾病导致的Y165C,G382D,466delE,E466X以及Y90X的突变已经在高加索人,印度人,巴基斯坦人以及其他种族中被报道过。其中Y165C及G382D突变在欧美高加索人群患者中突变率约占80%。其基本突变形式为Y165C→Y165C或G382D→G382D纯合型突变和Y165C→G382D复合型杂合性突变。但是,这两种高发突变却在包括日本人在内的东亚人种中未被检测到。提示这两种突变是种族特异性等位基因突变。基于上述发现,我们猜测日本结直肠患者MUTYH等位基因Y165C和G382D突变的低外显易感性与之前报道的APC和CHEK2基因突变的情况相似,即存在人种的差异。因此,我们检测三个日本MAP疑似家系的APC与MUTYH基因的全部外显子,发现一个新的MUTYH基因单核苷酸多态性位点MUTYH IVS1-5 A＞C。在283例日本结直肠癌患者和307对照人群中进行单核苷酸多态性检测。应用病例对照研究发现日本人群中MUTYH单核苷酸多态性位点IVS1-5 A＞C与结直肠癌发病密切相关。我们的结果表明MUTYH等位基因突变位点IVS1-5 A＞C很有可能是日本人群结直肠癌的易感位点之一。材料与方法一、材料1、家系三个疑似MAP受检家系血样标本均来源于日本浜松医科大学附属医院检验科。且经患者及其家族成员同意对其血样进行基因筛查。病理诊断由日本浜松医科大学附属医院病理部做出,病人资料由浜松医科大学附属医院住院部提供。2、血样及细胞系283例结直肠癌患者血样从日本浜松医科大学附属医院检验科获得。其结直肠癌患者病理诊断由日本浜松医科大学附属医院病理部做出。307例对照组血样来自20-74岁日本福冈地区无结直肠手术史,无家族性腺瘤样息肉病、炎症性肠病,有能力并自愿参加检测的非结直肠癌人群。实验中70种癌细胞系均有日本浜松医科大学第一病理提供。二、方法1、DNA提取对每个受检者抽取约5ml静脉血,经DNA提取试剂盒QIAamp（?）DNA BloodMaxi Kit提取受检者全血中DNA。2、RNA提取对每个受检者抽取约5ml静脉血,经RNA提取试剂盒PAXgene Blood RNA Kit提取受检者全血中RNA。3、细胞系DNA提取应用DNeasy（?）Tissue Kit提取70种癌细胞系DNA。4、引物的设计与合成在GENEBANK中登载人APC（NM 000038.2）及MUTYH（NM 012222.1）基因全序列,应用Oligo@SIGMA GENOSYS软件分别对APC及MUTYH基因全部外显子设计引物。5、PCR反应体系20μl PCR反应体系为:Hotstar Taq DNA聚合酶0.2u,10×PCR缓冲液包含15mM MgCl2共2μl,200μM dNTP 1.6μl,每种0.25μM引物0.2μl,加入1μl模板DNA,加双蒸水至20μl。反应条件设置为:95℃预变性15分钟,94℃变性30秒,退火30秒,72℃延伸1分钟,重复37个循环,最后72℃充分延伸10分钟。6、限制性内切酶反应体系20μl限制性内切酶反应体系为:PCR扩增产物15μl,10×缓冲液2μl,100×BSA0.2μl,各种限制性内切酶5u,37℃孵育过夜。7、单链构像多态性分析PCR扩增后产物或PCR扩增酶切后产物17μl与FEXB（95%甲酰胺,0.02MEDTA,0.05%溴酚蓝）按1:1.5比例混合,96℃变性15分钟后置于冰中。然后各取10μl上样于8%聚丙烯酰胺凝胶,在四种条件下（常温,常温+5%甘油,4℃,4℃+5%甘油）电泳,电压为150V。常温电泳3.5h,4℃电泳4.5h。然后将聚丙烯酰胺凝胶银染,观察结果,如果在凝胶上出现与正常对照组不同的条带,即泳动移位、多余条带或条带变宽者视为异常条带,提示有突变的可能性,待DNA测序分析。8、DNA测序在凝胶上出现异常条带者,应用Sanger双脱氧终止法对PCR-SSCP法检测出的可疑PCR产物进行测序。所用测序仪器为ABI PRISM 3100,测序前应用QIAquick PCR Purification Kit净化PCR产物,使用Nanodrop ND-1000分光光度仪对DNA进行定量。测序试剂为ABI BigDye（?）Terminater v3.1 Cycle Sequence Kit。序列分析软件为GENETYX8。9、相对的两对引物.聚合酶链反应针对MUTYH基因突变位点IVS1-5 A＞C设计引物,PCR-CTPP反应体系里同时加入两对引物,退火温度为60℃,共40个循环。10、逆转录聚合酶链反应从受检者全血中提取的RNA,经SuperScriptTM First-Strand Synthesis System逆转录为cDNA。11、实时荧光定量PCR针对MUTYH基因突变位点IVS1-5 A＞C设计引物。20μl实时荧光定量PCR反应体系为:从患者血中提取的RNA,在体外逆转录后,所得cDNA 5倍稀释后的cDNA 5μl,2×SYBR Master包含2.5mM MgCl2共10μl,每种0.5μM引物1μl,RNase-free water 3μl。样品采用LightCycler 3.0荧光定量PCR仪进行扩增。反应程序设定为:95℃预变性15分钟,94℃变性15秒,61℃退火20秒,72℃延伸10秒,重复50个循环,81℃数据收集。溶解曲线分析:从95℃起,以20℃/s的速度降温至65℃:在65℃孵育10分钟后,以0.1℃/s的速度升温至95℃。11、统计学方法以χ2检验比较各基因型,相关危险因素暴露在病例与对照之间分布的差异。以比值比及其95%可信区间表示相对危险度。所有的统计检验均为双侧概率检验。所用统计软件为SPSS12.0。实验结果一、三个日本疑似MAP家系患者APC与MUTYH基因PCR-SSCP及基因测序结果应用PCR-SSCP及基因测序方法检测日本三个疑似MAP家系患者APC与MUTYH基因全部外显子。结果发现APC基因11个SNP突变位点,发现MUTYH基因3个SNP突变位点。其中5个APC基因SNP突变位点及1个MUTYH基因SNP突变位点目前尚未见相关报道。二、SNP位点的选择以及应用PCR-CTPP方法检测SNP靶位点结果经过多年国内外相关研究,APC基因参与人类结直肠癌及FAP发生发展的相关机制已基本明确。由于本研究的主要目的在于探讨MUTYH与人类结直肠癌及FAP的相关性,所以虽然检测出APC基因11个SNP位点,而且其中有5个SNP位点未被报道,但是我们并未对APC基因的SNP位点进行更深入的探讨,而是选择目前国内外研究较少的MUTYH基因作为研究对象,选择目前未被报道的MUTYH IVS1-5 A＞C SNP突变位点作为研究靶点。应用PCR-CTPP方法检测日本浜松及福冈地区结直肠癌患者与非结直肠人群血液DNA中MUTYH IVS1-5 A＞C SNP突变位点的情况,结果发现在283例结直肠癌患者中发生MUTYH IVS1-5 A/C与MUTYH IVS1-5 C/C突变的人数分别为11人与2人,在307例非结直肠癌人群中发生MUTYH IVS1-5 A/C突变的人数为4人,但未发现MUTYH IVS1-5 C/C纯合性突变。三、MUTYH IVS1-5 A＞C多态性分析1、研究对象的基本特征本研究中所有的研究对象均为日本浜松及福冈地区人群,年龄范围20-74岁,结直肠癌组平均年龄为62.15±6.16,对照组的平均年龄为58.81±6.78,差异有显著性（U=6.27,P＜0.001）。结直肠癌组和对照组中男性频率分别为61.10%和52.10%,经卡方检验有显著性差异（χ2=4.87,P=0.027）。2、基因型分布情况在307名正常对照中303人（98.70%）为MUTYH IVS1-5基因野生型（A/A）,4人（1.30%）为MUTYH IVS1-5基因突变型杂合子（A/C）;结直肠癌病例组MUTYH IVS1-5基因野生型（A/A）,MUTYH IVS1-5基因突变型杂合子（A/C）,MUTYH IVS1-5基因突变型纯合子（C/C）基因型频率分别为95.41%,3.89%,0.70%。对照组中MUTYH IVS1-5 A/C等位基因频率为0.65%,结直肠癌组的MUTYHIVS1-5（A/C）及（C/C）频率为2.65%;经卡方检验有显著性差异（χ2=7.43,P=0.006）。3、MUTYH IVS1-5 A＞C多态性与日本人结直肠癌易感性的关系以携带MUTYH IVS1-5基因野生型（A/A）的个体为参照组,调整年龄、性别的混杂作用后,携带至少1个MUTYH IVS1-5等位基因（即A/C和C/C基因型）的个体罹患结直肠癌的危险显著增高,调整前后分别为OR=3.64（95%CI 1.17～11.32）和OR=3.60（95%CI 1.21～10.48）。四、RT-PCR与Real-time PCR结果我们从每个受检者静脉血中提取RNA,在体外逆转录为cDNA。RT-PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中成像。结果我们可以看到在两对不同引物的PCR反应体系中基因组DNA并未在琼脂糖凝胶电泳中出现条带,而受检者1 cDNA、受检者2cDNA、肠癌细胞系KATOⅢcDNA及肠癌患者cDNA在琼脂糖凝胶电泳中的影像并未见明显差异。然后我们应用Real-time PCR技术对MUTYH IVS1-5 A＞C在肠癌细胞系cDNA,非结直肠癌人群cDNA以及受检家系患者cDNA中的相对表达量进行检测。结果发现受检家系患者cDNA中MUTYH IVS1-5 A＞C的相对表达量明显高于肠癌细胞系cDNA,非结直肠癌人群cDNA。而肠癌细胞系cDNA与非结直肠癌人群cDNA中MUTYH IVS1-5 A＞C的相对表达量未见明显差异。五、应用PCR-CTPP方法检测70种癌细胞系DNA结果应用PCR-CTPP方法检测70种癌细胞系DNA,并未检测出MUTYH IVS1-5基因突变型杂合子（A/C）及MUTYH IVS1-5基因突变型纯合子（C/C）基因型。讨论结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,仅2000年全球就有945000新发病例,每年近50万人死于结直肠癌,仅次于肺癌、乳腺癌居恶性肿瘤发病率的第三位。结直肠癌在我国也是最常见的恶性肿瘤之一,目前居恶性肿瘤发病率第4位。近年来,结直肠癌的发病率呈明显上升趋势,已引起人们的广泛关注。结直肠癌的发生、发展是一个多因素、多阶段、多基因异常改变的复杂过程。可因原癌基因和抑癌基因突变累积而成,DNA损伤修复系统缺陷亦可导致基因突变率增高,促进肿瘤发生。DNA损伤修复系统是机体内主要的防御屏障,参与修复由内外环境因素所致的DNA损伤。DNA修复能力缺陷或低下将增加基因突变和细胞癌变的危险。研究表明,DNA修复能力低于一般人群平均水平的个体对肿瘤易感。因此,DNA修复能力的个体差异可能是决定肿瘤遗传易感性极其重要的因素。现在知道,许多DNA修复基因具有SNP,越来越多的研究表明SNP能导致氨基酸替换进而改变相应修复酶的活性。因此,DNA修复基因SNP是导致DNA修复能力个体差异的重要原因,特别是位于基因编码区或调节区的SNP。研究表明,DNA修复基因的遗传多态性可导致个体发生癌症的危险性增高。人类DNA损伤修复系统主要包括:碱基切除修复、核酸切除修复和错配修复等。而MUTYH是碱基切除修复的三级防御,MUTYH基因定位于1号染色体短臂p32.1到p34.3,长7.1kb,含有16个外显子,编码一个535个氨基酸的蛋白,MUTYH蛋白是一种特异的腺嘌呤转葡糖基酶,定位于细胞核和线粒体内。在DNA复制后它能迅速扫描子链DNA,切除子链DNA中与母链8-oxodG错配的A。如果MUTYH蛋白失活,则易导致复制过程中G:C→A:T的颠换,从而促进肿瘤的发生。目前MUTYH基因已发现多个单核苷酸多态性位点,其中研究比较多的是Y165C和G382D。在欧美高加索人群患者中,Y165C和G382D两个位点突变率约占80%,其基本突变形式为Y165C→Y165C或G382D→G382D纯合型突变和Y165C→G382D复合型杂合性突变。在亚洲,印度发现的MUTYH突变位点为Y90X和E466X,巴基斯坦为Y90X,日本报道了R231C纯合型双等位基因突变,和一个剪切位点的单等位基因突变IVS10-2 A＞G。在家族遗传性胃癌中也发现了MUTYH的突变,在日本发现IVS10-2 A＞G剪切位点的突变,在中国家族遗传性胃癌中,也发现了两个新的突变位点:Pro18Leu和Gly25Asp。在现有关于亚洲人的报道中,还未发现高加索人种中常见的Y165C和G382D两个位点的突变,这提示MUTYH基因的突变存在人种间的差异。本研究首次报道了碱基切除修复基因MUTYH在日本人群中的一个新的SNP突变位点MUTYH WS1-5 A＞C,并且就MUTYH IVS1-5A＞C多态性与日本人结直肠癌易感性的关系进行了分析。结果发现日本人群中携带MUTYH IVS1-5基因突变型杂合子（A/C）或MUTYH WS1-5基因突变型纯合子（C/C）基因型的个体罹结直肠癌的危险是携带MUTYH IVS1-5基因野生型纯合子（A/A）的3.64倍,调整年龄、性别的混杂作用前后,OR值仍为3.60。提示MUTYHIVS1-5 A＞C位点基因多态性在日本人群结直肠癌发生中起着作用。个别学者对MUTYH基因的点突变进行了功能分析。研究发现Y165C和G382D突变可以减低大肠杆菌中MutY的表达数量。他们同时使用底物类似物FA对酶作用底物亲和力进行评价,结果发现这两种突变均严重影响MUTYH识别FA以及区分鸟嘌呤与8-oxoG的能力。也许MUTYH IVS1-5 A＞CSNP突变位点也有类似的作用。此外,MUTYH IVS1-5 A＞C SNP突变位点位于MUTYH与复制蛋白A的结合位点。而RPA具有单链结合和解旋的功能,在DNA复制开始和延长阶段起着重要作用。在DNA复制过程中,RPA磷酸化可改变它与DNA结合的活性以及与参与DNA复制的各种蛋白质的相互作用,进而调节DNA复制。此外,RPA除了参与正常DNA的复制,还参与了DNA损伤应激反应,如核苷酸切除修复、DNA错配修复、同源重组和非同源末端连接等修复过程。这些均可能是提高MUTYH IVS1-5基因突变型携带者的结直肠癌易感性的原因,其具体机制还需进一步探讨。我们应用PCR-CTPP方法在人类70种癌细胞系DNA中对MUTYH WS1-5 A＞CSNP突变位点进行检测,结果并未检测出MUTYH基因突变。这可能是如Parker等报道的相似,即一部分微卫星稳定的癌细胞系虽然存在8-oxoG与A错配修复系统缺陷以及8-oxoG的增加,但并没有MUTYH基因突变被发现。而8-oxoG与A错配修复系统缺陷以及8-oxoG的增加的存在主要是由于在这些细胞系中MUTYH产物磷酸化缺陷的原因所致。我们对受检者1 cDNA、受检者2 cDNA、肠癌细胞系KATOⅢcDNA及肠癌患者cDNA进行RT-PCR检测,在琼脂糖凝胶电泳中的影像并未见明显差异。提示我们MUTYH IVS1-5 A＞C SNP突变位点对结直肠癌易感性的影响也许并不是造成其附近的MUTYH基因2号外显子DNA表达水平的改变。然后我们应用Real-time PCR方法对MUTYH IVS1-5 A＞C在肠癌细胞系cDNA、非结直肠癌人群cDNA以及受检家系患者cDNA中的相对表达量进行检测。结果发现受检家系患者cDNA中MUTYH IVS1-5 A＞C的相对表达量明显高于肠癌细胞系cDNA,非结直肠癌人群cDNA。而肠癌细胞系cDNA与非结直肠癌人群cDNA中MUTYH IVS1-5 A＞C的相对表达量未见明显差异。受检家系患者cDNA中MUTYH IVS1-5 A＞C的高表达这虽然与MUTYH这一DNA损伤修复基因的抑癌基因本质有所违背,但是同时提示我们MUTYH IVS1-5 A＞C SNP突变位点所在位置也许确实影响了其与复制蛋白A的结合,提高了APC基因的突变概率,从而增加了MUTYH IVS1-5基因突变型携带者的结直肠癌易感性。但是由于Real-time PCR的样本例数较少,因此还需后续试验扩大样本量对现有结果进行进一步的验证。结论本研究首次发现了DNA碱基切除修复基因MUTYH一个新的SNP突变位点MUTYHIVS1-5 A＞C,并且分析了MUTYH IVS1-5 A＞C多态性对日本人结直肠癌的发生存在一定的影响,提示MUTYH IVS1-5 A＞C多态性是构成日本人结直肠癌遗传易感性的重要因素,这对了解结直肠癌的发病机理及高危人群的筛检等方面都有一定积极意义。

论文目录

• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 英文缩略语
• 论文一
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 论文二
• 前言
• 材料与方法
• 讨论
• 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介