调控人类CYP3A4基因表达的表观遗传机制的研究

论文摘要

研究背景和目的：CYP3A4是重要的人类药物代谢酶,约占人肝脏及肠道中CYP总量的50%以上,约有60%以上的处方药物由CYP3A4参与催化代谢。CYP3A4在个体间存在明显的个体差异性,尽管国内外学者进行了近20年大量的研究,但CYP3A4活性个体差异的分子机制目前仍是一个谜团。目前,已经有相当多的报道证明CYP3A4表达的个体差异性与遗传多态性有关,而且在CYP3A4基因上发现了许多单核苷酸多态性（SNP）。但是经过研究也发现这些SNP在人群中的变异频率很低,且存在明显的种族差异,与CYP3A4活性的关联性也很难有确切的结论。因此,CYP3A4的基因多态性不可能是影响CYP3A4表达的主要因素。另有学者提出核受体PXR作为CYP3A4编码基因的上游调控关键因子,其自身基因序列的突变可能是导致下游基因转录活性发生改变的分子机制。但研究发现人PXR的基因序列的变异频率也很低,同样不可能是影响CYP3A4表达的主要因素。随着研究的不断深入,遗传学中的一个前沿领域：表观遗传学（epigenetics）,为人们提供了一个新思路。它不涉及DNA序列的变化,而是研究可遗传的基因表达的改变,研究如何通过激活、抑制某些基因的表达选择性地利用基因组的信息。目前,表观遗传学研究主要集中在DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑、非编码RNA调控等方面。研究证明CYP的某些成员可能是miRNA的靶基因,说明miiRNA在CYP的表达调控中可能有重要作用。本课题通过生物信息学软件预测与CYP3A4 mRNA 3’-UTR区有互补结合位点的miRNA,经过评分比较最终选取miRNA-526b与：niRNA-361-3p为研究对象,研究miRNA-526b与miRNA-361-3p对CYP3A4基因表达的影响。另外,有研究发现用曲古抑菌素A（TSA）处理HepG2细胞后,CYP3A4表达增加,我们推测转录因子与CYP3A4基因的结合很大程度地取决于组蛋白的甲基化／乙酰化状态,因此本课题也研究了组蛋白修饰对CYP3A4基因表达的影响。材料与方法：1.研究对象和标本收集取自5例肝血管瘤患者、1例肝癌患者行肝脏切除术后废弃的部分正常肝脏标本。根据取材时间用数字1-6为标本编号,其中5号标本取自肝癌患者,其他5例均取自肝血管瘤患者。本次研究方案得到郑州大学医学伦理委员会认可。2.观察指标分别观察以下指标：①HPLC法检测CYP3A4的活性差异：提取微粒体,以咪达唑仑为探针药,用高效液相色谱法（HPLC）测定各正常人肝微粒体CYP3A4酶活性；②Western blot法测定CYP3A4蛋白表达；③Real time PCR测定CYP3A4、PXR的mRNA水平及miRNA的表达量；④Chip-qPCR方法测定CYP3A4基因启动子区的ER-6元件以及增强子区的DR-3和ER-6元件的组蛋白修饰。3.统计学处理运用SPSS13.0统计软件包作统计学处理,采用mean±SD进行数据处理。相关性分析采用Pearson相关分析,以a=0.05为检验水准。结果：1. CYP3A4酶活性、蛋白表达及mRNA水平1.1 HPLC检测结果显示：咪达唑仑方法专属性、准确性、稳定性以及分离度良好,符合生物样品的测定要求,可用于测定人肝微粒体中咪达唑仑的含量。以探针药咪达唑仑的生物转化程度（turnover, TR）作为酶活性的研究指标,6例标本的CYP3A4酶活性分别为465.84、1180.04、791.45、851.52、606.86、1328.39μmol·min-1·mg-1。1.2 Western blot结果显示：以同一样本中CYP3A4的条带灰密度值与GAPDH条带灰密度值的比值来表示该样品中CYP3A4蛋白的相对表达量,6例标本的CYP3A4蛋白的相对表达量分别为0.3159、0.9023、0.8368、0.7574、0.7075、1.0611。1.3 Real time PCR实验结果显示：CYP3A4 mRNA水平的变异系数为0.6096。6例标本中,6号样本的CYP3A4 mRNA水平检测结果为高水平状态,其mRNA水平是低水平状态1号样本的5.8倍。PXR mRNA水平的变异系数为0.7504。6例标本中,6号样本的PXR mRNA水平检测结果为高水平状态,其mRNA水平是低水平状态1号样本的8.2倍。1.4 6例标本中,6号样本的各水平检测结果为高水平状态,活性、蛋白表达及mRNA水平分别是低水平状态1号样本的2.8倍、3.4倍及5.8倍。CYP3A4 mRNA的表达量和CYP3A4的蛋白表达量及酶活性均存在正相关（P<0.05）,CYP3A4 mRNA与PXR mRNA的表达量也存在正相关（r=0.9648,P<0.05）2. miRNA表达水平及与CYP3A4 mRNA表达的相关性miRNA-526b的表达与CYP3A4 mRNA的表达呈负相关,但经统计学处理无显著性差异（r=-0.575,P>0.05）,miRNA-361-3p的表达与CYP3A4 mRNA的表达呈负相关,但经统计学处理无显著性差异（r=-0.617,P>0.05）。3.组蛋白修饰的测定Chip-qPCR结果显示：近端启动子区的组蛋白乙酰化存在差异性,且与CYP3A4的表达水平一致。结论：1.CYP3A4mRNA的表达量与CYP3A4的蛋白量和酶活性及PXR mRNA表达量呈正相关。2. miRNA-526b和miRNA-361-3p的表达均与CYP3 A4 mRNA水平呈负相关,初步认为CYP3A4 mRNA为miRNA-526b和miRNA-361-3p的靶mRNA。3.转录因子PXR影响CYP3A4基因的表达与组蛋白修饰有关,组蛋白乙酰化可以上调CYP3A4基因的表达。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 表观遗传学在药物反应个体差异中的作用
• 参考文献
• 缩略词索引
• 个人简历
• 在读期间发表的学术论文
• 在读期间参加学术会议情况