骨形成蛋白-7基因修饰的骨髓间充质干细胞对肾缺血再灌注损伤修复作用的实验研究

论文摘要

目的观察骨形成蛋白-7（BMP-7）基因修饰的骨髓间充质干细胞（MSCs）对肾缺血再灌注损伤修复的影响,明确体内BMP-7对MSCs向肾细胞定向分化的影响。方法密度梯度离心法分离纯化大鼠MSCs。慢病毒介导BMP-7基因体外转染大鼠MSCs。PCR法检测BMP7-MSCs细胞上清BMP-7 mRNA的表达。建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）模型,通过下腔静脉注射将BMP7-MSCs移植入大鼠肾IRI模型,同时设立对照组。分别于细胞移植术后第3、5、7、30d取大鼠双侧肾检测各项指标（取肾前4h予腹腔注射BrdU,50mg/kg）:BrdU免疫组织化学染色检测细胞分裂活跃程度;上皮钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的免疫组织化学染色检测分析细胞的类型;胶原纤维染色检测分析肾脏纤维化情况;绿色荧光蛋白的荧光显微镜检测分析细胞是否来源于供体; PCR检测分析波形蛋白、a-平滑肌肌动蛋白、BMP-7蛋白、上皮钙粘蛋白表达量。结果1密度梯度离心法成功分离纯化大鼠MSCs。2 BMP-7修饰的重组MSCs构建成功,重组MSCs表达BMP-7。3 160例肾缺血再灌注损伤大鼠模型建立成功。4与对照组相比较,MSCs移植组在缺血再灌注肾损伤早期的Scr和BUN下降得更快（P<0.05）5与MSCs移植组比较,BMP7-MSCs移植组对大鼠缺血再灌注肾损伤早期Scr和BUN的升高的抑制作用更显著（P<0.05）。6与对照组相比,MSCs移植组的BrdU阳性细胞个数明显增多,两者差异有统计学意义（P<0.05）7与MSCs移植组相比, BMP7-MSCs移植组的BrdU阳性细胞个数明显增多,两者差异有统计学意义（P<0.05）。8.与MSCs移植组相比,BMP7-MSCs移植组的E-cadherin+/GFP+阳性细胞个数明显增多,两者差异有统计学意义（P<0.05）。9与对照组相比,MSCs移植组大鼠E-cadherin的mRNA明显增多,两者差异有统计学意义（P<0.05）。10与MSCs移植组相比,BMP7-MSCs移植组大鼠E-cadherin的mRNA明显增多,两者差异具有统计学意义（P<0.05）。11与空白对照组相比,MSCs移植组α-SMA的表达更低,两者差异有统计学意义（P<0.05）。12与MSCs移植组相比,BMP7-MSCs移植组α-SMA的表达更低,两者差异有统计学意义（P<0.05）。13与空白对照组相比,MSCs移植组Vimentin的表达更低,两者差异有统计学意义（P<0.05）。14与MSCs移植组相比,BMP7-MSCs移植组Vimentin的表达更低,差异有统计学意义（P<0.05）。15与对照组相比,MSCs移植组大鼠BMP-7的mRNA明显增多,两者差异有统计学意义（P<0.05）。16与MSCs移植组相比,BMP7-MSCs移植组大鼠BMP-7的mRNA明显增多,两者差异具有统计学意义（P<0.05）。结论密度梯度离心法能成功地分离纯化大鼠MSCs。通过慢病毒载体能成功高效地将BMP-7转染MSCs。外源MSCs和BMP7-MSCs对大鼠缺血再灌注肾损伤早期Scr和BUN的升高具有一定的抑制作用,能够促进缺血再灌注后肾损伤的肾脏细胞的增殖,能够定向分化为肾小管细胞而修复肾损伤,能够减轻肾IRI后肾间质纤维化程度;BMP7能够促进MSCs对肾损伤的修复。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 大鼠MSCs 的分离、培养及生物学特性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要仪器与产地
• 2.1.3 主要试剂与产地
• 2.1.4 试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 MSCs 的分离和培养
• 2.2.2 MSCs 的活性测定
• 2.2.3 MSCs 的鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 MSCs 的原代培养
• 2.3.2 MSCs的传代培养
• 2.3.3 MSCs 的生长曲线及鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 MSCs 自我更新及多向分化潜能
• 2.4.2 MSCs的异质性
• 2.4.3 MSCs 的分离方法
• 2.4.4 MSCs 的生长特性
• 第3章 BMP7 基因转染MSCs 的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要仪器与产地
• 3.1.2 主要试剂与产地
• 3.1.3 试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 BMP-7 慢病毒载体的构建
• 3.2.2 病毒感染细胞
• 3.2.3 重组蛋白表达检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 BMP-7 慢病毒载体构建成功
• 3.3.2 病毒成功转染大鼠 MSCs
• 3.3.3 重组 MSCs 表达 BMP7
• 3.4 讨论
• 3.4.1 载体的选择
• 3.4.2 标记方法的选择
• 3.4.3 靶细胞的选择
• 第4章 BMP7 基因修饰的 MSCs 对肾 IRI 修复作用的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验动物和分组
• 4.1.2 主要仪器与产地
• 4.1.3 主要试剂与产地
• 4.1.4 试剂的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验流程
• 4.2.2 大鼠MSCs的分离和培养
• 4.2.3 BMP-7 慢病毒载体的构建
• 4.2.4 携带BMP-7的慢病毒（表达GFP）感染大鼠MSCs
• 4.2.5 肾脏IRI大鼠模型的建立及MSCs移植
• 4.2.6 大鼠肾脏标本的获取
• 4.2.7 上皮钙粘蛋白（E-cadherin）免疫组织化学染色检查
• 4.2.8 5-溴脱氧尿核苷（BrdU）免疫组织化学染色检查
• 4.2.9 波形蛋白（Vimentin）免疫组织化学染色检查
• 4.2.10 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组织化学染色检查
• 4.2.11 胶原纤维 VG 染色
• 4.2.12 上皮钙粘蛋白（E-cadherin）mRNA 含量的 RT-PCR 检测
• 4.2.13 波形蛋白（Vimentin）m RNA 含量的RT-PCR 检测
• 4.2.14 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）m RNA 含量的 RT-PCR检测
• 4.2.15 骨形成蛋白7（BMP7）m RNA 含量的 RT-PCR检测
• 4.2.16 统计学分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 BMP7 基因修饰的重组MSCs（表达GFP）构建成功
• 4.3.2 大鼠肾脏 IRI 模型的建立成功
• 4.3.3 外源MSCs 、BMP7-MSCs 于肾IRI 后在肾组织的分布状况
• 4.3.4 外源MSCs 、BMP7-MSCs在肾IRI后定向分化为肾小管上皮细胞的情况
• 4.3.5 外源MSCs 、BMP7-MSCs 对肾IRI 后肾功能的影响
• 4.3.6 外源MSCs 、BMP7-MSCs对肾IRI后肾脏细胞增殖情况的影响
• 4.3.7 外源MSCs 、BMP7-MSCs 对肾IRI 后肾间质纤维化的影响
• 4.3.8 外源MSCs 、BMP7-MSCs 对肾IRI 后肾组织BMP7 表达的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 肾功能衰竭的治疗概况
• 4.4.2 BMP7 与肾
• 4.4.2.1 BMP-7 的分布
• 4.4.2.2 BMP-7 与肾脏发育
• 4.4.2.3 BMP-7 对肾小管上皮细胞表型的维持
• 4.4.2.4 BMP-7 对细胞外基质降解的促进作用
• 4.4.2.5 BMP-7对炎症反应的抑制
• 4.4.3 外源性 MSCs、BMP7-MSCs 向 IRI 肾脏趋向转移的情况
• 4.4.3.1 MSCs 的“归巢”特性
• 4.4.3.2 BMP7-MSCs 在肾 IRI 后的“归巢”
• 4.4.4 BMP7 对外源性MSCs 在肾IRI 后向肾小管细胞定向分化的影响
• 4.4.4.1 MSCs的多向分化潜能
• 4.4.4.2 外源性MSCs、BMP7-MSCs在肾IRI后向肾细胞定向分化、修复损伤的情况
• 4.4.5 外源性MSCs、BMP7-MSCs对肾IRI后细胞增殖的影响
• 4.4.6 外源性MSCs、BMP7-MSCs对肾IRI后间质纤维化的影响
• 4.4.6.1 BMP-7 对肾IRI 后间质纤维化的影响
• 4.4.6.2 外源MSCs 对肾IRI 后间质纤维化的影响
• 4.4.6.3 BMP7-MSCs 对肾 IRI 后间质纤维化的影响
• 4.4.7 肾IRI大鼠模型建立的经验总结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A BMP7 基因信息
• 附录B 综述
• 符彦基攻读学位期间的研究成果