论文摘要
Rab蛋白家族是Ras超家族（包括ras，rho／rac，rab，arf以及ran五大类）中最大的家族，是一类小分子量GTP酶，分子量大都在20～25kDa之间，表达于从酵母、果蝇、小鼠到人类等各种真核生物中，调节细胞器之间的囊泡运输。其在酵母中称为YPT／SEC，在高等真核生物中称为Rab。到目前为止，已有近70多种人类Rab蛋白或Rab-like蛋白编码基因被克隆和鉴定，其中包括一些剪切体。细胞内的囊泡运输是一个重要而又复杂的过程，这就意味着有多种Rab蛋白参与其中的调节。对新型Rab蛋白的研究，必将有助于我们进一步了解囊泡运输。本课题所研究的新基因mRabL5（GenBank登录号：NM 026073），编码一个预计分子量为20.7kDa的新型鼠源Rab-like蛋白。前期实验分析表明，mRabL5具备Rab蛋白家族的许多保守序列，并具有GTP酶活性。为了更好地研究mRabL5在囊泡运输中的作用，我们制备了针对mRabL5的多克隆抗体，并利用自制的抗体检测了mRabL5在小鼠组织中的表达情况，同时揭示了mRabL5的亚细胞定位，初步推测了其在囊泡运输中的功能，结果如下：1、制备了针对mRabL5特异性较好的多克隆抗体。我们利用谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体，将mRabL5基因全长及C端分别重组到原核表达载体pGEX-4T-1中，阳性的重组子在大肠杆菌表达菌株Rosetta中进行IPTG诱导表达。诱导表达后的两种可溶性融合蛋白用Sepharose 4B进行亲和纯化。纯化后的融合蛋白分别免疫家兔，获得了多克隆抗血清并经G蛋白亲和纯化。通过ELISA检测，自制的抗体效价高。western blot及免疫荧光结果表明两种自制的抗体能识别真核细胞表达的mRabL5蛋白，针对C端制备的抗体具备更好的特异性，实验检测非特异性信号少，是后续实验研究的理想工具。2、组织广谱表达的mRabL5与反面高尔基体网状结构共定位。通过western blot及组织切片免疫荧光实验，我们在小鼠各主要组织都检测到mRabL5的表达，表明其是一个广谱表达的Rab-like蛋白。利用高尔基复合体特异性指示探针C6-NBD-Ceramid，通过免疫荧光检测，我们发现mRabL5在细胞内聚集于核周一侧的分布形式与高尔基复合体的亚细胞定位一致。进一步我们用反面高尔基体网状结构（TGN）特异性指示探针发现，Nocodazole处理，能同时引起TGN与mRabL5亚细胞定位发生离散。除去Nocodazole后，两者恢复核周一侧聚集的共分布形式。而用两种内质网标记物：DiOC6、Texas red-labeled ConA，我们没有检测到mRabL5与之的共定位现象。Lyso Tracker Red标记的溶酶体与mRabL5也不呈现共定位。以上结果提示，作为一种组织广谱表达的Rab-like蛋白，mRabL5可能参与调节TGN有关的囊泡运输。3、mRabL5参与内吞途径。我们通过超速离心进行细胞组分分馏，发现mRabL5在细胞内有胞质可溶及膜结合两种存在形式。加入TRITC-WGA促进细胞内吞途径后，mRabL5在可溶性胞质及内膜系统中的分布比例发生变化。同时，通过免疫荧光实验，我们检测到内吞途径促进过程中，mRabL5与含有WGA结合位点的内涵体共定位。以上结果表明，mRabL5在细胞内循环于膜系统和胞质之间，参与TRTIC-WGA的内吞转运过程。综上所述，我们制备了两种多克隆抗体，针对C端的多克隆抗体具有更好的抗原特异性。利用该抗体，我们检测到mRabL5是一个广谱表达的蛋白，与TGN共定位，作为一种小G蛋白，循环于膜系统和胞质之间，参与内吞途径。