材料表面拓扑形貌的细胞响应以及PLGA组织工程多孔支架的制备与软骨组织修复研究

论文摘要

软骨缺损修复是再生医学领域非常有挑战性的一个课题。组织工程学的出现,将可能使人们从传统的器官移植和植入这种以伤补伤的方法进入到一个器官制造的新时代,其为软骨缺损修复提供了新的思路和方法。软骨组织的损伤或者缺损往往会伴随软骨下骨的改变,近年来,采用双层支架来模拟关节软骨和软骨下骨各自内在结构和生理功能以实现软骨和软骨下骨的同时修复成为一个新思路,但关于双层支架的很多基本问题还有待于进一步探索。未来生物材料的设计需要对于材料的细胞响应有深入的认识。近几十年来的相关研究已经大大加深了人们对于“生物材料”涵义的理解,同时也提供了更多探索的方向。材料的诸多因素可以影响细胞行为,其中,表面形貌的效应普遍存在,并且由于形貌改变可不涉及化学成份的改变,故相应的材料改性容易最终获得批准应用。本博士论文以聚乳酸—羟基乙酸共聚物（PLGA）这种有应用价值的可降解高分子为基质材料,开展了生物医用材料方面的研究。论文首先从二维平面探索微米拓扑形貌的细胞响应行为并得出基本规律,继而将其应用于三维多孔支架中,最后再用组织工程双层支架进行关节软骨和软骨下骨同时修复的动物实验。该研究有助于理解材料物理因素对于细胞的作用,为生物材料设计提供指导。本论文的主要创新性工作包括以下几方面：1.制备了一系列不同尺寸的微米阵列,研究其细胞响应行为,并发现适合骨髓基质干细胞黏附的尺寸。本论文在二维PLGA膜表面制备了一系列不同高度（深度）的微柱（微坑）阵列,然后研究骨髓基质干细胞在这些拓扑形貌表面的生长情况。根据实验结果,我们发现1μm高度（或深度）的微柱（或微坑）阵列相对于其它高度（或深度）的阵列更利于细胞的生长。进一步我们比较了1μm微坑和1μm微柱,发现1μm微柱比微坑和光滑膜更适合骨髓基质干细胞的黏附。2.利用材料表面微柱阵列实现了对于细胞核严重自我变形的调控。本论文工作过程中,意外发现新生大鼠骨髓基质干细胞细胞核在特定高度的PLGA微柱阵列表面能发生严重自我变形；细胞核变形并非是由细胞核的重力作用引起的,而可能是由细胞铺展时的内应力导致；尽管骨髓基质干细胞发生了如此严重的细胞核变形,其仍具备增殖和成骨分化的能力。本文通过设计不同微柱阵列,成功控制了细胞核的形状,在国际上首次实现了哑铃形、方形、十字交叉等异常细胞核形状。此外进一步研究了另外五种细胞（Hela、PC12、NIH3T3、MC3T3、 Chondrocyte）,发现细胞在微柱阵列表面的细胞核变形现象具有普适性；同时其响应程度具有细胞类型依赖性。3.通过设计新型致孔剂实现了三维PLGA多孔支架内部孔结构以及孔壁拓扑形貌的控制。基于粒子浸出技术,首次通过对石蜡球致孔剂表面物理修饰的办法调控了组织工程支架内表面微米拓扑形貌。在石蜡球这种致孔剂粒子表面通过氯化钠粒子的撞击制备出微米尺寸的凹坑,然后再把这些微米拓扑形貌转移到三维多孔支架孔表面,从而获得微米凸起结构。三维多孔支架中的这些微米凸起能促进新生Sprague Dawley （SD）大鼠骨髓基质干细胞的黏附,同时并不影响干细胞的增殖和分化。此外,还首次发明“糖粘盐”这种新型致孔剂,使得制备得到的组织工程支架具有规则的球形孔形状以及良好的连通性,并且孔表面具有微米拓扑形貌。制备得到的组织工程多孔支架利于SD大鼠骨髓基质干细胞的生长。这些研究成果为组织工程和再生医学中的材料设计提供新的视野和技术。4.设计了PLGA双层多孔支架,并通过合作研究,探讨了支架物理参量对于体内关节软骨修复效果的影响。在动物实验之前,本论文按照国家标准“医疗器械生物学评价”的相关要求设计了PLGA支架材料体内外的生物相容性实验,并研究了其在新西兰大白兔体内的降解行为。通过实验,发现PLGA支架材料细胞毒性小,血液相容性好,且不会在骨/软骨缺损处引起明显的炎症反应,同时具有合适的降解速率。另外,制备了双层支架以修复新西兰大白兔骨/软骨缺损,并首次实现对双层支架中各层最优孔隙率、孔径探索。设计并制备好双层支架后,通过合作研究,将PLGA双层支架植入新西兰大白兔骨/软骨缺损处（直径4mm,深度5mm）,以检验各组支架对其修复效果。术后12周,从大体观、H&E染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化染色、组织学评分和相关基因的表达这些结果中我们得出：软骨段支架孔隙率为92%,骨段支架孔隙率为77%的双层支架及软骨段孔径为100-200μm,骨段孔径为300-450μm的双层支架能实现比其它孔隙率或孔径组合更好的修复效果。除了上述工作以外,在“复旦大学博士生短期国际访学资助计划”资助下赴美国密歇根大学进行为期4个月短期交流期间,我还合成了两组分的聚酸酐,并研究了其表面溶蚀性能、制备了药物释放装置。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 组织工程支架
• 1.1.1 主要的组织工程材料类型
• 1.1.1.1 天然的高聚物
• 1.1.1.2 人工合成的高聚物
• 1.1.1.3 无机材料
• 1.1.2 组织工程多孔支架的制备方法
• 1.1.2.1 改进的适度温度下热压/粒子浸出技术
• 1.1.2.2 常温模压/粒子浸出制备技术
• 1.1.2.3 常温注塑成型/粒子浸出制备技术
• 1.1.3 PLGA多孔支架的性能
• 1.1.3.1 PLGA支架材料的力学性能
• 1.1.3.1.1 共聚物组分的影响
• 1.1.3.1.2 干/湿状态的影响
• 1.1.3.1.3 PLGA支架孔隙率的影响
• 1.1.3.1.4 PLGA支架孔形状的影响
• 1.1.3.1.5 其它因素的影响
• 1.1.3.2 PLGA支架材料的降解行为
• 1.1.3.2.1 PLGA支架材料体外降解的三阶段
• 1.1.3.2.2 孔径、孔隙率对PLGA支架降解行为的影响
• 1.1.3.2.3 其它因素的影响
• 1.1.3.2.3.1 PLGA共聚物的组成
• 1.1.3.2.3.2 PLGA共聚物的结晶度
• 1.1.3.2.3.3 温度和pH
• 1.1.3.2.3.4 力学刺激
• 1.1.3.2.3.5 体内降解行为
• 1.1.4 组织工程支架的表面修饰
• 1.2 材料表面拓扑形貌的细胞响应行为
• 1.2.1 纳米尺度拓扑形貌
• 1.2.1.1 细胞黏附
• 1.2.1.2 细胞增殖
• 1.2.1.3 细胞迁移
• 1.2.1.4 细胞分化
• 1.2.2 微米尺度拓扑形貌
• 1.2.2.1 细胞黏附
• 1.2.2.2 细胞增殖
• 1.2.2.3 细胞迁移
• 1.2.2.4 细胞分化
• 1.3 组织工程双层支架用于修复骨/软骨缺损
• 1.4 课题的提出
• 参考文献
• 第二章 微米拓扑形貌的尺寸对骨髓基质干细胞的响应行为的影响
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 原料与试剂
• 2.2.2 PLGA微米拓扑阵列的制备
• 2.2.3 PLGA膜的表征
• 2.2.4 细胞的分离和培养
• 2.2.5 细胞的肌动蛋白、纽蛋白和细胞核荧光染色
• 2.2.6 骨髓基质干细胞的成骨分化
• 2.2.7 MTT表征细胞活力
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 利用微柱阵列控制骨髓基质干细胞的细胞核形状
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 原料与试剂
• 3.2.2 PLGA微柱阵列的制备
• 3.2.3 PLGA膜的表征
• 3.2.4 细胞的分离和培养
• 3.2.5 细胞骨架和细胞核荧光染色
• 3.2.6 骨髓基质干细胞的成骨分化
• 3.2.7 MTT表征细胞活力
• 3.2.8 细胞核形状的定量表征
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 骨髓基质干细胞核变形现象的发现
• 3.3.2 骨髓基质干细胞核形状的控制
• 3.3.3 核变形的普适性与细胞种类依赖性
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 组织工程三维多孔支架孔表面微米拓扑形貌的构建
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 原料与试剂
• 4.2.2 带微米拓扑形貌的石蜡球致孔剂的制备
• 4.2.3 三维多孔支架的制备与表征
• 4.2.4 骨髓基质干细胞的分离和培养
• 4.2.5 MTT表征细胞活力
• 4.2.6 骨髓基质干细胞的成骨分化
• 4.2.7 多孔支架中细胞数量的测量
• 4.2.8 碱性磷酸酶的定量测定
• 4.2.9 统计分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 表面带有微米凹坑的石蜡球致孔剂的制备
• 4.3.2 孔表面带有微米凸起的组织工程三维多孔支架的制备
• 4.3.3 三维多孔支架孔表面细胞的黏附和增殖
• 4.3.4 三维多孔支架孔表面干细胞的成骨分化
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 新型支架致孔剂“糖粘盐”粒子的制备与相应三维多孔支架的研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 原料与试剂
• 5.2.2 “糖粘盐”致孔剂的制备
• 5.2.3 三维多孔支架的制备与表征
• 5.2.4 骨髓基质干细胞的分离和培养
• 5.2.5 MTT表征细胞活力
• 5.2.6 骨髓基质干细胞的成骨分化
• 5.2.7 多孔支架中细胞数量的测量
• 5.2.8 碱性磷酸酶的定量测定
• 5.2.9 统计分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 “糖粘盐”致孔剂的制备
• 5.3.2 用“糖粘盐”致孔剂制备三维多孔支架
• 5.3.3 三维多孔支架中骨髓基质干细胞的行为
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 PLGA支架材料生物相容性及降解行为研究
• 6.1 前言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 原料与试剂
• 6.2.2 实验动物
• 6.2.3 新西兰兔骨髓基质干细胞的获取
• 6.2.4 PLGA支架的制备
• 6.2.5 PLGA支架与细胞复合体的构建与表征
• 6.2.6 PLGA支架载细胞的动态观察
• 6.2.7 PLGA浸提液的细胞毒性
• 6.2.8 PLGA浸提液血液相容性
• 6.2.9 PLGA支架体内植入与降解
• 6.2.10 PLGA支架中山羊BMSC与平面培养的肋软骨细胞共培养体外诱导向成软骨分化
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 PLGA支架与细胞复合体的构建
• 6.3.2 培养于PLGA支架中的细胞的动态观察
• 6.3.3 PLGA支架材料浸提液的细胞毒性
• 6.3.4 PLGA浸提液的血液相容性
• 6.3.5 PLGA支架材料的体内植入与降解
• 6.3.6 PLGA支架材料中山羊BMSC与平面培养的肋软骨细胞共培养体外诱导向成软骨分化
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 第七章 不同孔隙率分布双层支架修复兔关节软骨/软骨下骨缺损
• 7.1 前言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 原料与试剂
• 7.2.2 PLGA双层支架的制备
• 7.2.3 PLGA双层支架力学性能的测试
• 7.2.4 实验动物
• 7.2.5 骨髓基质干细胞的分离、培养与传代
• 7.2.6 细胞示踪标记
• 7.2.7 体外接种细胞及其电镜表征
• 7.2.8 动物模型制备
• 7.2.9 取材及组织学观察
• 7.2.9.1 标本处理
• 7.2.9.2 H&E染色
• 7.2.9.3 甲苯胺蓝染色
• 7.2.9.4 番红O-固绿染色
• 7.2.9.5 免疫组织化学染色
• 7.2.10 Real-time PCR检测相关基因表达
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 PLGA双层支架的制备
• 7.3.2 PLGA双层支架的力学性能
• 7.3.3 PLGA双层支架植入骨/软骨缺损
• 7.3.4 组织学/免疫组织学检测和评分
• 7.3.5 相关基因的表达
• 7.4 本章小结
• 参考文献
• 第八章 不同孔径分布双层支架修复兔关节软骨/软骨下骨缺损
• 8.1 前言
• 8.2 实验部分
• 8.2.1 原料与试剂
• 8.2.2 PLGA双层支架的制备
• 8.2.3 动物实验
• 8.3 结果与讨论
• 8.3.1 PLGA双层支架的制备
• 8.3.2 PLGA双层支架植入骨/软骨缺损
• 8.3.3 骨/软骨缺损修复大体观和断面观察
• 8.3.4 组织学检查
• 8.3.5 相关基因的表达
• 8.4 本章小结
• 参考文献
• 第九章 全文总结
• 9.1 论文的主要工作
• 9.2 论文工作的主要创新性
• 9.3 论文的理论和实际意义
• 9.4 论文的不足与展望
• 作者简历
• 致谢