低密度脂蛋白与血小板免疫活化的关联及对血管内皮细胞动脉粥样硬化相关基因表达的影响

论文摘要

研究背景及总体思路最近一系列研究进一步认识了动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）潜在的病理生理机制,认为AS是一种动态进展性、炎症性疾病,低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c）升高是AS发生发展的主要原因,是引发血管内皮炎症反应的罪魁祸首。高胆固醇血症病人LDL-C在引发起始炎症反应直至血栓形成过程中都起到了至关重要的作用,LDL-C水平越高,冠心病的危险性就越大,降低LDL-C能够阻止冠心病进展最直接的证据就是他汀类药物能够通过降低LDL-C来减少冠心病事件的发生率。然而一项新近的研究表明LDL-C降幅与AS的程度并没有明显的关联。以往认为血小板不主动参与免疫反应。血小板没有细胞核,不是一个完整的细胞单位。但近年研究发现,当发生组织损伤时,血小板被激活可表达多种与免疫炎症有关的膜蛋白及受体如整合素αIIβ3（PAC-1）、CD40L、P-选择素等并分泌炎性因子如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素3（interleukin-3,IL-3）、白介素6（interleukin-6,IL-6）,以及粘附分子如CD36等参与了免疫炎症反应,血小板胞质内的微粒不仅起着抗凝促凝作用,也参与细胞间的相互作用。血小板微粒可促进单核细胞与内皮细胞相互作用,并刺激单核细胞分泌粘附分子。特别是血小板可以表达CD40和CD40配体（CD40 Ligand, CD40L）这一发现,提示血小板在免疫炎症反应中起重要作用。因为CD40/CD40L广泛参与了细胞炎症反应和免疫网络。现已认识到,活化的血小板能像其它免疫细胞一样,通过CD40/CD40L通路,调控炎症反应、免疫调节和血液稳态等许多生物学活动。这些作用可通过在血小板膜表面表达CD40,或者血小板活化后表达CD40L来实现,在诸如动脉硬化、糖尿病,炎症反应性等多种疾病中起着重要的调节作用,并逐渐成为研究的新领域。血管内皮细胞是AS发生发展网络中极其重要的一环,内皮细胞损伤或功能障碍很可能就是AS发生的始动环节或发展的推动因素。近年来随着研究的深入,发现许多内皮细胞基因表达与AS的发生、发展有关。如Kotowicz等在体外实验发现人血管内皮细胞、平滑肌细胞和单核/巨噬细胞在无血清条件下也能表达CD40-CD40L ,在IL-1β、INF-α及氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激下表达明显增强。CD40-CD40L相互作用可以促进这些细胞表达粘附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase , MMP）和组织因子（tissue factor , TF）等。又如过氧化物酶体增殖活化受体α（Peroxisome proliferator activated receptorα,PPAR-α）,为一与脂代谢、糖代谢及多种炎症相关基因表达有关的过氧化物酶体增殖活化受体的一亚型,为一核受体,在AS损伤区有PPAR-α表达,内皮细胞、平滑肌细胞及单核细胞源性巨噬细胞中PPAR-α的表达量均是升高的。在巨噬细胞和泡沫细胞PPAR-α的激活能够抑制诱导型NO合酶（iNOS）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及清道夫受体A表达,PPAR-α还有抑制单核细胞向粥样硬化损伤区的趋化作用。再如,环氧合酶2（cooxygenase-2 ,COX-2）也参与了AS的发展,在AS的损伤区存在COX-2表达,但COX-2对AS的正向或负向作用还存在争议,确定的是COX-2在AS的斑块组织中表达是升高的,受核因子κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）的调节。Metzner J等在载脂蛋白E（apolipoproteinE,apoE）基因缺失小鼠模型中发现COX-2抑制剂在AS进展期抑制AS发展,但在AS形成早期却促进AS形成。随着研究的深入,越来越多的研究结果支持COX-2与炎症反应有关,促进AS发生发展。基于LDL-C在AS发生、发展中的作用及存在的争议;近来有关血小板在免疫学和炎症方面功能的新发现以及血管内皮细胞上诸多与AS相关基因的发现与研究的深入,尽管近来血小板免疫活化在心血管疾病发生发展中有少量研究报道,但缺乏LDL与血小板免疫活化关联的直接研究,LDL与免疫活化血小板对血管内皮细胞AS相关基因表达的影响及他汀类药物对血小板免疫活化的直接影响未见报道。在高血脂环境中或LDL刺激下,血小板免疫活化会出现什么样的改变?他汀类药物干预效果如何?血小板免疫活化对血管内皮细胞内与AS有关基因PPAR-α,COX-2的表达会有什么样的影响?LDL在其中起什么样作用?途径及机制如何?因此本课题研究如下:1、检测高LDL-C患者氟伐他汀治疗前后血脂水平和血小板PAC-1及CD40L表达;观察高LDL-C患者血浆对体外血小板PAC-1及CD40L表达的影响及氟伐他汀的干预作用;用LDL直接或辅助刺激血小板,氟伐他汀干预,观察LDL对血小板CD40L及PAC-1表达的影响及氟伐他汀的作用。2、用免疫活化的血小板与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）加或不加LDL共孵育,实时定量RT-PCR、Western BLOT、ELISA、核因子活性检测等技术观察HUVECs COX-2及PPAR-α的表达情况并探讨LDL的作用。3、相应的拮抗剂CD40L单抗阻断CD40/CD40L通路及重组人CD40L（rhCD40L）直接刺激HUVECs模拟激活CD40-CD40L通路,观察HUVECs COX-2及PPAR-α的表达,探究其作用途径及机制。第一部分血脂对血小板免疫活化的影响目的利用流式细胞术、RT-PCR、WESTEN BLOT、ELISA等方法观察高LDL-C患者氟伐他汀治疗前后血小板PAC-1及CD40L表达情况;观察高LDL-C患者血浆和单纯LDL对体外健康人血小板PAC-1、CD40L表达的影响及氟伐他汀的作用,探讨高脂血症患者血小板免疫活化的变化,LDL对血小板免疫活化的影响及氟伐他汀干预的作用和机制。材料和方法1购买机采血小板,过滤白细胞,使血小板达到实验所需质量要求,并对其进行体外保存培养。2选择20例LDL-C明显升高而甘油三酯不高（triglycerin,TG）的单纯高LDL血症患者,氟伐他汀治疗4周（40mg/日）,治疗前后均对血脂、血小板PAC-1及CD40L表达进行检测。3用3例高LDL-C患者血浆体外培养健康人血小板并用氟伐他汀进行干预,检测血小板表面PAC-1、及CD40L表达情况,研究高LDL-C患者血浆对血小板PAC-1及CD40L表达的影响及氟伐他汀的干预作用。4用LDL和/或ADP干预体外培养血小板,并用氟伐他汀进行干预,流式细胞术、RT-PCR及WESTERN Blot等技术检测血小板CD40L mRNA及蛋白的表达,进一步探索LDL对血小板免疫活化的影响及氟伐他汀干预作用。5实验分组第一节高LDL-C血症患者血小板PAC-1、CD40L表达及氟伐他汀的作用根据实验方案分为3组（n=20）（1）健康对照组:血脂正常的健康人20例。（2）高LDL-C治疗前组:LDL-C>4.0mmol/L,TG<1.7mmol/L的高脂血症患者20例,排除肝肾疾病、高血压、糖尿病、甲亢、感染性疾病及其它一些慢性炎症性疾病。（3）高LDL-C治疗后组:20例上述患者行氟伐他汀治疗（40mg /日）4周后。第二节高LDL-C血浆对血小板免疫活化的影响及氟伐他汀的作用根据实验方案分为4组（n=18）:（1）对照组:12小时内健康人血小板。（2）正常LDL-C组:正常健康人血浆培养血小板,22℃水平振荡培养4天。选择3人份血浆,每份血浆培养血小板6次。选择标准:健康中年男性,无吸烟嗜好。（3）高LDL-C组:高LDL-C患者血浆培养血小板,22℃水平振荡培养4天。选择了3人份血浆,每份血浆培养血小板6次。选择标准:中年男性,无吸烟嗜好,其它排除标准同第一节。（4）高LDL-C+氟伐他汀组:高LDL-C患者血浆培养血小板并同时加入高浓度氟伐他汀(终浓度10-2mol/L),22℃水平振荡培养4天,血浆来源同第（3）组。第三节LDL对血小板免疫活化的影响及氟伐他汀作用根据实验方案实验分为6组（n=8）保存条件为:37℃,5%CO2细胞培养箱中培养保存,培养基为无血清RPM1640。（1）对照组:单纯血小板保存培养12小时。（2）低浓度LDL组:终浓度5μg/mL的LDL+血小板共保存培养12小时。（3）较高浓度LDL组:终浓度50μg/mL的LDL+血小板共保存培养12小时。（4）ADP对照组:终浓度1μmol/L的ADP+血小板共保存培养12小时。（5）较高浓度LDL+ADP组:终浓度50μg/mL的LDL+血小板共保存培养30分钟后+终浓度1μmol/L的ADP共保存培养12小时。（6）氟伐他汀干预组:终浓度为10-2mol/L的氟伐他汀+终浓度50μg/mL的LDL+血小板共保存培养30分钟后+终浓度1μmol/L的ADP共保存培养12小时。6检测指标及方法（1）流式细胞术及镜下计数进行血小板浓度及纯度检测。（2）流式细胞术检测血小板表面PAC-1及CD40L表达。（3）RT-PCR检测血小板CD40L mRNA表达。（4）WESTERN BLOT检测血小板CD40L蛋白表达。（5）ELISA法检测共保存培养液中可溶性CD40L（Souluble CD40 ligand,sCD40L）浓度。结果第一节高LDL-C血症患者血小板PAC-1、CD40L表达及氟伐他汀作用1高LDL-C治疗后组患者血浆LDL-C的水平较高LDL-C患者治疗前组明显降低（3.98±0.57 VS 4.97±0.67,P<0.01）。2高LDL-C患者治疗前组血小板PAC-1表达阳性率较对照组显著升高（9.47±1.96 VS 5.73±1.20,P<0.01）;高LDL-C患者治疗后组PAC-1表达阳性率与高LDL-C患者治疗前组相比明显降低（7.29±1.35 VS 9.47±1.96,P<0.01）。3高LDL-C患者治疗前组血小板CD40L表达阳性率较对照组显著升高（3.04±0.62 VS 1.87±0.49,P<0.01）;高LDL-C患者治疗后组CD40L表达阳性率与高LDL-C患者治疗前组相比亦明显降低（2.17±0.53 VS 3.04±0.62,P<0.01）。4血浆LDL-C浓度与血小板PAC-1表达阳性率之间存在线性相关（r=0.497,n=60,P<0.01）,血浆LDL-C浓度与血小板CD40L表达阳性率之间也存在线性相关（r=0.473,n=60,P<0.01）。第二节高LDL-C患者血浆对血小板免疫活化的影响及氟伐他汀的作用1正常LDL-C组培养4天血小板PAC-1表达阳性率较对照组升高（6.39±1.23 VS 3.75±1.06,P<0.01）,高LDL-C组患者血浆培养4天血小板表达PAC-1阳性率较正常LDL-C组显著升高（10.47±1.39 VS 6.39±1.23,P均<0.01）;高LDL-C+氟伐他汀组血小板PAC-1表达阳性率与高LDL-C组相比无明显改变（10.39±1.41 VS 10.47±1.39,P>0.05）。2正常LDL-C组培养4天血小板CD40L表达阳性率较对照组显著升高（1.87±0.47 VS 0.75±0.41,P<0.01）,高LDL-C患者血浆培养4天血小板表达CD40L阳性率较正常LDL-C组显著升高（3.19±0.73 VS 1.87±0.47,P均<0.01）;高LDL-C+氟伐他汀组血小板CD40L表达阳性率与高LDL-C组相比亦无明显变化（3.21±0.69 VS 3.19±0.73,P>0.05）。3将培养血浆中LDL-C浓度与血小板PAC-1及CD40L表达阳性率进行直线回归分析,发现LDL-C浓度与血小板PAC-1表达阳性率之间有线性关系（P<0.05）,回归方程为?=4.037+1.127X;同时LDL-C浓度与血小板CD40L表达阳性率之间亦有线性关系（P<0.05）,其回归方程为?=1.056+0.385X。第三节LDL对血小板免疫活化的影响及氟伐他汀作用1 LDL干预和/或ADP刺激对血小板PAC-1表达的影响及氟伐他汀作用低浓度LDL组血小板PAC-1表达阳性率与对照组相比未见明显改变（3.84±1.71 VS 3.87±1.63,P>0.05）;较高浓度LDL组血小板PAC-1表达阳性率与对照组相比亦未见明显增加（3.99±1.74 VS 3.87±1.63,P>0.05）;ADP对照组血小板PAC-1表达阳性率与对照组相比显著增加（11.31±2.12 VS 3.87±1.63,P<0.01）;而较高浓度LDL+ADP组血小板PAC-1表达阳性率较ADP对照组高（17.73±2.09 VS 11.31±2.12, P<0.05）;氟伐他汀干预组PAC-1表达阳性率与较高浓度LDL+ADP组相比未见明显变化（17.81±2.15 VS 17.73±2.09,P>0.05）。2 LDL干预和/或ADP刺激对血小板CD40L表达的影响及氟伐他汀作用低浓度LDL组血小板CD40L表达阳性率与对照组相比未见明显改变（0.78±0.47 VS 0.77±0.44,P>0.05）;较高浓度LDL组血小板CD40L表达阳性率与对照组相比亦未见明显增加（0.83±0.46 VS 0.77±0.44,P>0.05）;ADP对照组血小板PAC-1表达阳性率与对照组相比显著增加（2.91±0.69 VS 0.77±0.44,P<0.01）;而较高浓度LDL+ADP组血小板CD40L表达阳性率较ADP对照组高（4.17±0.71 VS 2.91±0.69,P<0.05）氟伐他汀干预组CD40L表达阳性率与较高浓度LDL+ADP组相比未见明显降低（4.09±0.76 VS 4.17±0.71,P>0.05）。3 LDL干预和/或ADP刺激对可溶性CD40L（Souluble CD40 ligand,sCD40L）浓度的影响及氟伐他汀作用低浓度LDL组培养液中sCD40L浓度与对照组相比未见明显增加（4.14±1.47μg/L VS 3.81±1.27μg/L,P>0.05）;较高浓度LDL组sCD40L浓度与对照组相比有增加趋势（4.37±1.54μg/L VS 3.81±1.27μg/L）,但经统计学检验差异无显著性（P>0.05）;ADP对照组sCD40L浓度与对照组相比显著增加（9.31±2.12μg/L VS 3.81±1.27μg/L ,P<0.01）;而较高浓度LDL+ADP组sCD40L浓度较ADP对照组高（11.38±2.19μg/L VS 9.31±2.12μg/L,P<0.05 ）;氟伐他汀干预组sCD40L浓度较LDL+ADP组未见降低（11.27±2.11μg/L VS 11.38±2.19μg/L,P>0.05）。4 LDL干预和/或ADP刺激对血小板CD40L mRNA表达的影响及氟伐他汀的作用。低浓度LDL组小板CD40L mRNA的表达相对量与对照组相比未见明显变化（0.97±0.08 VS 0.99±0.07, P>0.05）;较高浓度LDL组CD40L mRNA的表达相对量与对照组相比有所增加（1.10±0.12 VS 0.99±0.07）,但经统计学检验无显著差异（P>0.05）;ADP对照组血小板CD40L mRNA的表达量与对照组相比无明显改变（1.02±0.09 VS 0.99±0.07,P>0.05）;而较高浓度LDL+ADP组CD40L mRNA表达与对照组相比亦无升高（0.98±0.08 VS 0.99±0.07,P>0.05）;氟伐他汀干预组CD40L mRNA表达与较高浓度LDL+ADP组相比无明显变化（1.04±0.10 VS 0.98±0.08,P>0.05）。5 LDL干预和/或ADP刺激对血小板CD40L蛋白表达的影响及氟伐他汀的作用。低浓度LDL组小板CD40L蛋白表达相对量与对照组相比未见明显变化（0.90±0.12 VS 0.96±0.10,P>0.05）;较高浓度LDL组CD40L蛋白的表达相对量与对照组相比亦无显著增加（1.05±0.17 VS 0.96±0.10,P>0.05）;ADP对照组血小板CD40L蛋白的表达量与对照组相比显著增加（1.40±0.21 VS 0.96±0.10,P<0.01）;而较高浓度LDL+ADP组CD40L蛋白表达较ADP对照组高（1.63±0.19 VS 1.40±0.21,P<0.05）;氟伐他汀干预组CD40L蛋白表达较LDL+ADP组未见降低（1.59±0.21 VS 1.63±0.19,P>0.05）。小结血小板表面可表达多种与免疫炎症有关的膜蛋白及受体如GPⅡb/Ⅲa （PAC-1）、CD40配体（CD40L）、CD40受体、P-选择素等,它们在介导血小板免疫应答及炎症反应中发挥了极其重要的作用,血小板在正常状态下不表达或很少表达这些蛋白,当血小板在某些炎症因子或激活剂如ADP刺激下这些蛋白表达会迅速增加,称之为免疫炎症活性增加或免疫活化。本研究发现高LDL-C患者血小板PAC-1及CD40L的表达较正常对照组明显升高,说明高LDL-C患者血小板免疫活性增加或处于一定程度的免疫活化状态,通过LDL-C浓度与血小板PAC-1及CD40L表达量的直线回归分析发现两者具有线性关系,也说明了LDL-C与血小板免疫活化有关。氟伐他汀治疗一个月后,患者LDL-C降低的同时,血小板PAC-1及CD40L的表达较治疗前也明显降低,说明氟伐他汀在降低LDL-C的同时,也抑制了血小板的免疫活化。通过4天培养,发现体外高LDL-C患者血浆较正常LDL-C血浆更明显促进血小板PAC-1及CD40L表达,进一步说明LDL-C的量与血小板免疫活化增加有关,但在体外干预实验中并没有观察到氟伐他汀能够明显抑制血小板PAC-1及CD40L的表达,表明氟伐他汀体外不能直接抑制血小板免疫活化。血小板膜上存在LDL受体,为进一步观察LDL能否直接促进血小板免疫活化,在体外用单纯LDL直接干预血小板培养,发现低浓度（5μg/mL）和较高浓度的LDL（50μg/mL）并不能直接引起血小板PAC-1及CD40L表达增加,但较高浓度的LDL能显著增加ADP激活的血小板PAC-1及CD40L表达,表明LDL并不能直接促进血小板免疫活化,而可能是起血小板增敏作用,促进了血小板对其它激活物质的敏感性。从而推测高LDL-C引起血小板PAC-1及CD40L表达的增加可能是血浆中ox-LDL或其它炎症介质等潜在激活物引起的,LDL-C可能起到了一种血小板增敏作用或增加了这些潜在血小板激活物的量或活性。第二部分免疫活化血小板与LDL对HUVECs COX-2、PPAR-α表达及活性的影响目的通过血小板与HUVECs加或不加LDL的共孵育,体外观察ADP激活血小板对HUVECs COX-2和PPAR-α表达的影响及LDL的作用。方法1 HUVECs培养将HUVECs株复苏后置于5%CO2培养箱中37℃培养传代,贴壁24小时后细胞外观形态由扁变薄,体积增大、核清晰,数目增多,部分呈现多边形,聚集的细胞逐渐分散形成明显的细胞间隙,大约48-72小时呈分布均匀而密布的细胞单层。台盼蓝染色法计算细胞存活率在95%以上。在实验干预前,采用细胞计数板将细胞调整为2х106浓度,放入6孔板中培养,待细胞完全贴壁后进行实验干预。2血小板的保存培养及与内皮细胞的共孵育从血液中心购取机采血小板,用白细胞过滤器进行进一步白细胞过滤,并进行血小板计数及白细胞、红细胞含量测定（方法同前）,用血小板专用保存袋在血小板震荡保存机中22℃水平振荡条件下保存。实验前用22℃PBS液洗涤、22℃、4000G、10分钟离心,反复2次后,将细胞浓度调整至2×107/ml,用RPMI1640培养基于37℃、5%CO2细胞培养箱中短时间与HUVECs共孵育。3血小板活化方法血小板在ADP的作用下激活,PAC-1表达增加,同时CD40L的表达也会增加,因血小板CD40L广泛参与了免疫炎症反应,称之为免疫活化,为达到较多血小板活化数量本研究采用了终浓度为5μmol/L的ADP活化血小板。4实验分组根据实验方案实验共分为6组（n=6）（1）对照组:HUVECs更换培养基后于37℃、5%CO2培养箱中培养8小时。（2）血小板对照组:血小板与HUVECs以2 x107:2×106的比例于37℃5%CO2培养箱中共孵育8小时。（3）LDL对照组:将终浓度为50μg/mL的LDL加入HUVECs培养液中于37℃、5%CO2培养箱培养8小时。（4）ADP对照组:将终浓度为5μmol/L的ADP加入HUVECs培养液中于37℃、5%CO2培养箱培养8小时。（5）血小板活化组:在血小板与HUVECs共孵育中加入终浓度为5μmol/L的ADP于37℃、5%CO2培养箱中共孵育8小时。（6）血小板活化+LDL组:在血小板与HUVECs共孵育中加入终浓度为50μg/L的LDL 30分钟后加入终浓度为5μmol/L的ADP于37℃、5%CO2培养箱中共孵育8小时。5检测指标及方法（1）RT-PCR定性检测HUVECs CD40 mRNA的表达。（2）RT-PCR检测HUVECs COX-2及PPARαmRNA的表达。（3）WESTERN BLOT法检测HUVECsCOX-2及PPARα蛋白的表达。（4）ELISA法检测共孵育或培养液中PGE2的浓度。（5）EIA法检测核因子PPARα的活性。结果1免疫活化血小板对HUVECs COX-2 mRNA表达的影响及LDL的作用正常HUVECs有极少量COX-2 mRNA的表达,血小板对照组和ADP对照组HUVECs COX-2 mRNA的表达与对照组相比无明显变化（ 0.68±0.21 VS 0.53±0.17,0.77±0.25 VS 0.53±0.17,P均>0.05）,LDL对照组HUVECs COX-2 mRNA的表达似乎有增加,但无统计学差异（0.83±0.26 VS 0.53±0.17,P>0.05）;血小板活化组HUVECs COX-2 mRNA的表达较ADP对照组及血小板对照组明显升高（1.49±0.27 VS 0.53±0.17,1.49±0.27 VS 0.68±0.21,P<均0.01）,血小板活化+LDL组HUVECs COX-2 mRNA的表达较血小板活化组明显升高（1.79±0.20 VS 1.49±0.27,P<0.05）。2免疫活化血小板对HUVECs PPAR-αmRNA表达的影响及LDL的作用正常HUVECs有极少量PPAR-αmRNA的表达,血小板对照组、ADP对照组和LDL对照组HUVECs PPAR-αmRNA的表达与对照组相比均无明显变化（1.17±0.16 VS 1.13±0.17,1.19±0.19 VS 1.13±0.17和1.12±0.14 VS 1.13±0.17,P均>0.05）;血小板活化组HUVECs PPAR-αmRNA的表达较ADP对照组及血小板对照组明显升高（1.45±0.21 VS 1.19±0.19,1.45±0.21 VS 1.17±0.16,P均<0.01）;血小板活化+LDL组HUVECs PPAR-αmRNA的表达较血小板活化组明显升高（1.74±0.23 VS 1.45±0.21,P<0.05）。3免疫活化血小板对HUVECs COX-2蛋白表达的影响及LDL的作用正常培养的HUVECs有极少量COX-2蛋白的表达,血小板对照组、ADP对照组和LDL对照组HUVECs COX-2蛋白的表达与对照组相比改变均无明显统计学意义（0.70±0.07 VS 0.57±0.07,0.71±0.07 VS 0.57±0.07和0.58±0.07 VS 0.57±0.07,P均>0.05）;血小板活化组HUVECs COX-2蛋白表达较血小板对照组及ADP对照组明显升高（1.60±0.15 VS 0.70±0.07,1.60±0.15 VS 0.71±0.07,P均<0.01）;血小板活化+LDL组HUVECs COX-2蛋白的表达较血小板活化组升高（1.97±0.15 VS 1.60±0.15,P<0.05）。4免疫活化血小板对HUVECs PPAR-α蛋白表达的影响及LDL的作用正常HUVECs亦有少量PPAR-α蛋白的表达,血小板对照组、ADP对照组HUVECs PPAR-α蛋白的表达与对照组比较无显著变化（0.96±0.07 VS 0.98±0.08,0.95±0.09 VS 0.98±0.08,P均>0.05）;LDL对照组HUVECs PPAR-α蛋白表达与对照组相比似乎有所增加,但无显著统计学差异（1.12±0.012 VS 0.98±0.08,P>0.05）;血小板活化组HUVECs PPAR-α蛋白表达较血小板对照组及ADP对照组明显升高（1.63±0.14 VS 0.96±0.07,1.63±0.14 VS 0.95±0.09,P均<0.01）;血小板活化+LDL组HUVECs PPAR-α蛋白的表达也较血小板活化组升高（1.95±0.16 VS 1.63±0.14,P<0.05）。5免疫活化血小板对HUVECs COX-2活性的影响及LDL的作用通过检测孵育液中PGE2的浓度来反应免疫活化血小板与HUVECs共孵育后COX-2活性的变化,HUVECs培养液中有一定基础浓度的PGE2（21.31±2.34pg/mL）;血小板对照组、ADP对照组和LDL对照组培养液中PGE2浓度与对照组相比均无明显变化（ 23.73±2.53 pg/mL VS 21.31±2.34pg/mL , 22.26±2.27pg/mL VS 21.31±2.34pg/mL,25.74±3.12 pg/mL VS 21.31±2.34pg/mL,P均>0.05）;血小板活化组培养液中PGE2浓度较血小板对照组及ADP对照组明显升高（42.46±5.57 pg/mL VS 23.73±2.53 pg/mL,42.46±5.57 pg/mL VS 22.26±2.27pg/mL,P均<0.01）;血小板活化+LDL组培养液中PGE2浓度较血小板活化组升高（64.35±6.19 pg/mL VS 42.46±5.57 pg/mL, P<0.01）。6免疫活化血小板对HUVECs PPARα结合活性的影响及LDL的作用培养HUVECs PPARα具有一定的与反应元件结合的基础能力,相对结合活性为0.56±0.14;血小板对照组、ADP对照组和LDL对照组PPARα的相对结合活性与对照组相比均无明显变化（0.61±0.14 VS 0.56±0.14,0.58±0.13 VS 0.56±0.14和0.64±0.16 VS 0.56±0.14,P均>0.05）;血小板活化组PPAR-α相对结合活性较对照组似乎有所增加,但无显著统计学意义（0.73±0.18 VS 0.56±0.14,P>0.05）;血小板活化+LDL组PPAR-α相对结合活性较对照组亦没有显著增加（0.76±0.17 VS 0.56±0.14,P>0.05）。小结血管内皮细胞的损伤或功能障碍很可能就是AS发生的始动环节或发展的推动因素,内皮细胞PPARα及COX-2的表达均参与了AS的发生与发展。近期研究结果支持COX-2与炎症反应有关,能促进AS发生发展。而PPAR-α的激活通过抑制诱导型NO合酶（iNOS）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及清道夫受体A表达,抑制单核细胞向粥样硬化损伤区的趋化等作用发挥抗AS的作用。血小板能够通过表达的配体及受体与内皮细胞结合或调节其它细胞与内皮细胞的粘附及募集,影响与AS相关基因的表达,血小板的这种作用在其免疫活化时迅速放大。本研究通过免疫活化血小板与HUVECs共孵育培养来观察免疫活化血小板对HUVECs的直接作用,观察其对HUVECs COX-2、PPARα表达及活性的影响,并同时观察LDL在其中的作用。结果发现ADP活化的血小板既能明显促进HUVECs COX-2的表达,也能明显促进PPARα表达,COX-2表达升高的同时,其活性也明显升高,但PPARα在表达升高的同时,其活性并没有明显升高;而未活化的血小板在培养时间内对HUVECs COX-2及PPARα表达及活性无明显作用,这些结果表明了免疫活化的血小板可能会通过血管内皮细胞COX-2的表达及活性升高参与AS的发生、发展。PPARα在表达升高的同时其活性并没有明显升高,说明升高的PPARα并没有发挥相应的作用。本研究观察到单独LDL不能直接促进HUVECs COX-2及PPARα的表达,但能明显加强免疫活化血小板的这种作用,LDL的这种作用可能与上一部分我们讨论的促进血小板敏化有关以外,也有可能通过内皮细胞上的LDL受体促进内皮细胞的敏化。第三部分:CD40/CD40L通路在免疫活化血小板对HUVECs COX-2、PPAR-α表达中的作用目的血小板上有CD40L的表达,而血管内皮细胞上有CD40受体的表达,通过在免疫活化血小板与HUVECs共孵育培养的基础上,预先在相应组加入抗人CD40L单克隆抗体（CD40L mAb）,阻断CD40L-CD40通路,观察通路阻断的相应效果,然后用重组人CD40L（rhCD40L）直接刺激HUVECs观察有无相应的拟效应,来研究CD40/CD40L通路在免疫活化血小板促进HUVECs COX-2、PPAR-α表达中的作用。方法1 HUVECs培养同第二部分。2血小板的保存培养及与内皮细胞的共孵育同第二部分。3血小板活化方法同第二部分。4实验分组分为5组（n=6）（1）对照组:单纯HUVECs无血清1640于37℃、5%CO2培养箱中培养8小时。（2）血小板活化组:在血小板与HUVECs共孵育组中加于中等刺激浓度的ADP（5μmol/L）于37℃5%CO2培养箱中共孵育8小时。（3）CD40L mAb+血小板活化组:在血小板与HUVECs共孵育组中先加入终浓度为1μg/mL的小鼠抗人CD40L单克隆抗体,30分钟后加入终浓度为5μmol/L的ADP共孵育8小时。（4）同型对照IgG+血小板活化组:在血小板与HUVECs共孵育组中先加入终浓度为1μg/mL的小鼠同型对照IgG,30分钟后加入终浓度为5μmol/L的ADP于37℃5%CO2培养箱中共孵育8小时。（5）rhCD40L组:在无血清RPMI1640培养的单纯HUVECs中加入终浓度为0.4μg/mL的rhCD40L于37℃5%CO2培养箱中培养8小时。5检测指标及方法（1）RT-PCR定性检测HUVECs CD40 mRNA的表达。（2）Real time RT-PCR检测HUVECs COX-2及PPARαmRNA的表达。（3）WESTERN BLOT法检测HUVECs COX-2及PPARα蛋白的表达。（4）ELISA法检测共孵育或培养液中PGE2的浓度。（5）EIA法检测核因子PPARα的活性。结果1 CD40/CD40L通路干预对HUVECs COX-2 mRNA表达的影响血小板活化组HUVECs COX-2 mRNA的表达较对照组升高了将近7倍（7.09±0.45 VS 1.0±0.15,P<0.01）;CD40L mAb+血小板活化组HUVECs COX-2 mRNA的表达较对照组尽管升高（3.25±0.17 VS成1.00±0.15,P<0.01）但升高程度较血小板活化组明显降低约54%（3.25±0.17 VS 7.09±0.45, P<0.01）;而同型对照IgG+血小板活化组HUVECs COX-2 mRNA表达与血小板活化组相比没有明显降低（6.86±0.33 VS 7.09±0.45 P>0.05）;rhCD40L组HUVECs COX-2 mRNA的表达水平较对照组明显升高（3.48±0.17 VS 1.0±0.15,P<0.01）。2 CD40/CD40L通路干预对HUVECs PPARαmRNA表达的影响血小板活化组HUVECs PPARαmRNA的表达较对照组升高了约4.5倍（4.59±0.58 VS 1.00±0.28,P<0.01）;CD40L mAb+血小板活化组HUVECs PPARαmRNA的表达较对照组尽管升高（2.49±0.59 VS 1.0±0.28,P<0.01）但升高程度较血小板活化组明显降低约41%（2.49±0.59 VS 4.59±0.58 P<0.01）;同型对照IgG+血小板活化组HUVECs PPARαmRNA表达与血小板活化组相比没有明显降低（4.24±0.79 VS 4.59±0.58 P>0.05）;与HUVECs COX-2 mRNA表达不同,rhCD40L组HUVECs PPARαmRNA的表达水平较对照组无明显升高（1.52±0.34 VS 1.00±0.28,P>0.05）。3 CD40/CD40L通路干预对HUVECs COX-2蛋白表达的影响与COX-2 mRNA表达一致,血小板活化组HUVECs COX-2蛋白的表达较对照组明显升高（1.66±0.17 VS 0.90±0.09,P<0.01）;CD40L mAb+血小板活化组HUVECs COX-2蛋白的表达较对照组尽管升高（1.22±0.11 VS 0.90±0.09,P<0.05）但升高程度较血小板活化组明显降低（1.22±0.11 VS 1.66±0.17 P<0.01）;同型对照IgG+血小板活化组HUVECs COX-2蛋白表达与血小板活化组相比没有明显改变（1.69±0.15 VS 1.66±0.17 P>0.05）;rhCD40L组HUVECs COX-2蛋白的表达水平较对照组有明显升高（1.14±0.10 VS 0.90±0.09,P<0.01）。4 CD40/CD40L通路干预对HUVECs PPARα蛋白表达的影响与PPARαmRNA表达基本一致,血小板活化组HUVECs PPARα蛋白的表达较对照组有明显升高（1.41±0.14 VS 1.05±0.08,P<0.01）;CD40L mAb+血小板活化组HUVECs PPARα蛋白的表达较血小板活化组明显降低（1.04±0.09 VS 1.41±0.14,P<0.01）;而同型对照IgG+血小板活化组HUVECs PPARα蛋白表达与血小板活化组相比没有明显降低（1.35±0.15 VS 1.41±0.14, P>0.05）;rhCD40L组HUVECs PPARα蛋白表达较对照组无明显变化（1.01±0.11 VS 1.05±0.08,P>0.05）。5 CD40/CD40L通路干预对COX-2活性的影响血小板活化组培养液中PGE2的浓度与对照组相比有显著的增加（42.82±4.85 pg/mL VS 21.71±2.43 pg/mL, P<0.01）; CD40L mAb+血小板活化组培养液中PGE2浓度较血小板活化组明显降低（31.65±5.69pg/mL VS 42.82±4.85 pg/mL,P<0.01）,但仍较对照组为高（31.65±5.69pg/mL VS 21.71±2.43pg/mL, P<0.01）;而同型对照IgG+血小板活化组PGE2浓度与血小板活化组相比无明显改变（43.72±5.03pg/mL VS 42.82±4.85 pg/mL,P>0.05）;rhCD40L组PGE2浓度较对照组明显升高（34.76±5.27pg/mL VS 21.71±2.43 pg/mL,P<0.01）。6 CD40/CD40L通路干预对HUVECs PPARα结合活性的影响血小板活化组HUVECs PPARα结合活性似乎有所增加,但无统计学显著意义（0.73±0.18 VS 0.56±0.14,P>0.05）;CD40L mAb+血小板活化组HUVECs PPARα结合活性与血小板活化组相比无明显降低（0.69±0.17 VS 0.73±0.18,P>0.05）;同型对照IgG+血小板活化组HUVECs PPARα结合活性与血小板活化组相比亦无明显变化（0.71±0.15 VS 0.73±0.18, P>0.05）;rhCD40L组HUVECsPPARα结合活性与对照组相比亦未见明显升高（0.59±0.15 VS 0.56±0.14,P>0.05）。小结血小板在免疫活化后CD40L表达增多,同时伴有sCD40L的释放,sCD40L能发挥CD40L同样的生物学作用。研究证明血管内皮细胞上有CD40受体的表达,本研究也证实了这一点。有研究认为CD40L与CD40相互作用能使内皮细胞粘附分子E-选择素、VCAM-1、ICAM-1和TF、MCP-1的表达增高。本研究在免疫活化血小板与内皮细胞共孵育的基础上,加入CD40L/CD40通路的阻断剂,或用rhCD40L直接刺激HUVECs,对CD40/CD40L通路进行干预,观察免疫活化血小板促进HUVECs COX-2及PPARα的表达与CD40L/CD40通路有无关系。结果发现在预先加入CD40L mAb情况下COX-2的表达明显降低,而且用rhCD40L直接干预HUVECs也明显促进COX-2的表达,说明免疫活化血小板促进HUVECs COX-2的表达可能部分是通过CD40L/CD40通路实现的。而在加预先加入CD40L单抗的情况下虽然PPARα的表达也明显降低,但是用rhCD40L直接干预HUVECs并未观察到PPARα的表达有明显变化,表明免疫活化血小板促进PPARα表达增加可能不是直接通过CD40L/CD40通路实现的,而有可能是在COX-2或其它基因表达升高或活化后的一种被动性升高。总结论1高LDL-C患者血小板PAC-1及CD40L表达增加,氟伐他汀治疗后血小板PAC-1及CD40L表达明显降低,血浆LDL-C浓度与血小板PAC-1及CD40L阳性表达率有直线相关性。2体外高LDL-C血浆促进健康人血小板PAC-1及CD40L的表达,氟伐他汀不能降低血小板PAC-1及CD40L的表达, LDL-C的浓度与血小板PAC-1及CD40L表达阳性率具有线性关系。3单纯LDL（5μg/mL-50μg/mL）不能促进血小板免疫活化的增加,但LDL能促进ADP激活血小板,显著增加血小板的免疫活化,其CD40L蛋白的表达和培养液中sCD40L的浓度较单纯等浓度的ADP刺激显著增加。LDL的这种作用可能与其增加了血小板对激活物的敏感性有关。4免疫活化血小板能够促进HUVECs COX-2的表达及COX-2活性的增加。5免疫活化血小板亦促进HUVECs PPARα的表达,但PPARα活性无明显增加。6单纯LDL（5μg/mL-50μg/mL）不能影响HUVECs COX-2及PPARα的表达,亦不能促进它们活性的增加,但较高浓度的LDL（50μg/mL）能够显著促进免疫活化的血小板刺激HUVECs表达COX2及PPARα的作用。7 CD40L mAb能够部分抑制免疫活化血小板促进HUVECs COX-2表达及COX-2活性的增加,单纯CD40受体拟激动剂rhCD40L亦能够一定程度直接激活HUVECs,促进COX-2的表达和COX-2活性的增加,表明免疫活化血小板促HUVECs COX-2表达及活性升高部分是通过CD40-CD40L通路实现的。8 CD40L mAb能够部分抑制免疫活化血小板促进HUVECs PPARα的表达,但是单纯CD40受体拟激动剂rhCD40L不能明显改变HUVECs PPARα的表达,表明免疫活化血小板促进HUVECs PPARα的表达不是直接通过CD40-CD40L通路实现的,可能是内皮细胞激活的一种被动性反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 血脂对血小板免疫活化的影响
• 材料与方法
• 第一节 高LDL-C 患者血小板PAC-1、CD40L 表达及氟伐他汀作用
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第二节 高LDL-C 血浆对血小板免疫活性的影响及氟伐他汀作用
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第三节 LDL 对血小板CD40L 表达的影响及氟伐他汀作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 免疫活化血小板对HUVECs COX-2、PPAR-α表达及活性的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 CD40/CD40L 通路在免疫活化血小板对 HUVECs COX-2、PPAR-α表达中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A
• 附录 B
• 攻读学位期间的研究成果