新型雌激素受体调节因子GA5的功能研究

论文摘要

雌激素受体（ER）是核受体超家族成员之一,它包括ERα和ERβ两种亚型。ER在乳腺癌的发生、发展中发挥重要作用,目前认为ER是乳腺癌内分泌治疗的靶标和预后的指标之一。当前,乳腺癌内分泌的治疗主要是通过降低ER转录活性而实现。因此调节ER转录活性的蛋白因子的发现和相应功能研究对于有效开发治疗雌激素相关疾病的药物具有重要的意义。雌激素受体对其下游基因的表达调节是1个复杂的、多种因素参与的过程。其中,分布于不同组织中的共调节因子（包括共激活因子和共抑制因子）能够与雌激素受体结合进而影响其转录激活活性。相对于ERα,ERβ发现的比较晚,其共调节因子发现得就更少,为深入研究ERβ在雌激素应答基因转录调节中的作用方式,发现新型的转录共调节因子,我们以ERβ的AF-2区段为诱饵从人乳腺cDNA文库中筛选到了一个功能未知的候选新基因GA5。为了深入研究GA5基因的功能,我们做了以下研究并取得相应的成果。（1）成功构建了GA5原核表达载体PGEX-KG-GA5,在大肠杆菌中诱导表达的GST-GA5蛋白经纯化后免疫小鼠得到多克隆抗体,该抗体可特异识别GA5蛋白。（2）用自制多克隆抗体进行Western blot检测分析GA5蛋白在不同乳腺癌细胞内源表达量的差异,得知GA5在不同乳腺癌细胞中的表达量不一样,且有被修饰的可能。（3）构建了GA5 siRNAs真核表达载体,通过Western blotting实验证明,构建的siRNA能有效抑制GA5基因的表达,为进一步研究GA5在肿瘤中的功能提供了理想的研究工具。（4）酵母双杂交实验已证明GA5与ER在体内外均存在相互作用,因此,GA5有可能通过与ER相互作用,参与雌激素信号通路的调控。为此,我们构建了ERα、ERβ真核表达载体pIRESpuro2-Flag-ERα和pIRESpuro2-Flag-ERβ,证明Flag-ERα和Flag-ERβ融合蛋白在293T细胞中成功表达;用荧光素酶ERE-luc检测pIRESpuro2-Flag-ERα和pIRESpuro2-Flag-ERβ转录活性,发现在雌激素存在的情况下,pIRESpuro2-Flag-ERα和pIRESpuro2-Flag-ERβ转录活性分别提高了7倍和6倍。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号及缩写说明
• 第一章 雌激素及雌激素受体
• 1.1 雌激素
• 1.2 雌激素受体（ER）
• 1.2.1 ER的组织分布
• 1.2.1.1 ER在泌尿生殖器官的分布
• 1.2.1.2 ER在心血管系统和骨的分布
• 1.2.1.3 ER在中枢神经系统的分布
• 1.2.2 雌激受体生理作用
• 1.3 雌激素受体亚型（ERα和ERβ）的结构和生理学意义
• 1.3.1 ERα和ERβ的结构
• 1.3.2 ERα和ERβ的生理学意义
• 1.3.3 ERβ的作用机制
• 1.3.3.1 经典的基因组途径
• 1.3.3.2 非经典的基因组途径
• 1.3.3.3 非基因组途径
• 第二章 共调节因子对ER转录的调节及其与肿瘤关系的研究进展
• 2.1 雌激素受体共调节因子概述
• 2.2 共调节因子与ER的关系
• 2.3 与ERα和ERβ都结合的共调节因子
• 2.3.1 SRC家族
• 2.3.2 PGC-1
• 2.3.3 hADA3
• 2.3.4 PELP1/MNAR
• 2.3.5 NFAT3
• 2.3.6 N-CoR和SMRT
• 2.3.7 RIP140
• 2.4 与ERβ特异结合的共调节因子
• 2.4.1 HSP27
• 2.4.2 Com-1
• 第三章 新型雌激素受体共调节因子GA5基因
• 3.1 GA5基因的发现
• 3.2 GA5基因的生物信息学特征
• 3.3 GA5基因的功能
• 第四章 GA5原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要实验材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要实验仪器及设备
• 4.2.4 主要溶液配方
• 4.2.5 引物设计
• 4.2.6 PCR扩增目的片段
• 4.2.7 酶切PCR产物和载体
• 4.2.8 PCR产物及载体回收
• 4.2.9 目的片段与载体连接
• 4.2.10 连接产物转化
• 4.2.10.1 DH5α大肠杆菌感受态细胞制备
• 4.2.10.2 连接产物转化感受态细胞
• 4.2.11 重组质粒鉴定
• 4.2.12 GST-GA5蛋白诱导表达
• 4.2.12.1 BL21感受态细胞的制备
• 4.2.12.2 GST-GA5融合蛋白的诱导表达
• 4.2.12.3 SDS-PAGE电泳
• 4.2.12.4 Western blot免疫印迹
• 4.2.13 GST-GA5融合蛋白纯化
• 4.2.14 GST-GA5多克隆抗体制备
• 4.2.15 Western blot检测GST-GA多克隆抗体活性
• 4.2.15.1 细胞转染
• 4.2.15.2 待测细胞样品的处理
• 4.2.15.3 SDS-PAGE电泳
• 4.2.15.4 Western blot免疫印迹
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 PGEX-KG-GA5重组质粒的构建
• 4.3.1.1 PCR扩增GA5基因
• 4.3.1.2 重组质粒GST-GA5酶切鉴定
• 4.3.1.3 Western blot检测GST-GA5融合蛋白表达
• 4.3.2 GST-GA5融合蛋白的大量纯化
• 4.3.3 GA5基因在哺乳动物细胞中的表达及多克隆抗体的鉴定
• 4.3.4 GA5蛋白在不同乳腺癌细胞株的表达
• 4.4 讨论
• 4.4.1 制备GA5蛋白多克隆抗体的意义
• 4.4.2 检测GA5蛋白在不同乳腺癌细胞中表达的意义
• 第五章 GA5RNA干扰载体的构建及其干扰效果
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要实验材料
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要实验仪器及设备
• 5.3 GA5 siRNAs真核表达载体的构建
• 5.3.1 GA5 siRNAs的设计及合成
• 5.3.2 siRNA载体pSliencer 2.1-U6 neo酶切及胶回收
• 5.3.3 寡核苷酸片段与siRNA载体连接
• 5.3.4 连接产物的转化
• 5.3.5 Western blotting检测构建的GA5 siRNA表达载体的干扰效果
• 5.3.5.1 干扰载体转染哺乳动物细胞
• 5.3.5.2 待测细胞样品的处理
• 5.3.5.3 SDS-PAGE电泳及Western blot免疫印迹
• 5.4 结果分析
• 5.4.1 GA5 siRNAs靶序列测序分析
• 5.4.2 GA5 siRNAs对GA5基因表达的影响
• 5.5 讨论
• 5.6 小结
• 第六章 ERα、ERβ真核表达载体的构建及转录活性测定
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 主要实验材料
• 6.2.2 主要试剂
• 6.2.3 主要实验仪器及设备
• 6.2.4 引物设计及合成
• 6.2.5 PCR扩增目的片段
• 6.2.6 酶切PCR产物和载体
• 6.2.7 PCR产物及载体回收
• 6.2.8 目的片段与载体连接
• 6.2.9 连接产物转化及阳性克隆鉴定
• 6.2.10 Western blotting检测Flang-ERα、Flang-ERβ融合蛋白表达
• 6.2.11 转录活性检测
• 6.2.11.1 哺乳动物细胞转染
• 6.2.11.2 转录活性检测
• 6.3 结果
• 6.3.1 带有Flang标签的ERα和ERβ重组质粒构建
• 6.3.2 Flang-ERα、Flang-ERβ在293T细胞中的表达鉴定
• 6.3.3 pIRESpuro2-Flag-ERα、pIRESpuro2-Flag-ERβ转录活性的测定
• 6.4 讨论
• 6.4.1 ER亚型真核表达载体构建的意义
• 6.4.2 使用真核表达载体pIRESpuro2的优势
• 6.5 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表的论文