论文摘要
虽然转基因小鼠等动物均已成功构建并在研究中运用,但基因组序列与人类更接近的犬,至今未见有转基因构建的成功报道,原因是其在实践操作中存在诸如自然获得胚胎数目少、超排效果不明显等难点。采集卵巢上未成熟卵母细胞,经过体外成熟培养、受精来获得大量胚胎资源已被认为是比较可行的方法。同时犬的卵母细胞胞质暗黑,不可见原核,故只能通过胚胎卵周隙或胞浆注射代替常规的原核显微注射法来构建转基因犬,这就需要运用高效率的转基因技术。慢病毒系统是很好的选择,可以通过慢病毒载体携带目的基因感染胚胎,达到构建转基因犬的目的。故本研究围绕构建NR2B转基因犬这一主题,开展了卵母细胞体外成熟培养和选用NR2B作为目的基因进行慢病毒生产鉴定这两个方面的基础研究。由于犬生殖生理的特殊性,其卵母细胞体外培养成熟率（即达到MII期）较低,要寻找一个具有较高成熟率的卵母细胞体外培养体系,其中最关键的是体外成熟培养液的成分,是否需添加激素、蛋白、生长因子等物质以及添加的浓度。本研究中,我们采集不同年龄和发情周期的犬卵巢,切割法分离卵丘卵母细胞复合体,比较一级卵母细胞获得率;对卵母细胞进行体外培养,分别对培养基添加物—血清、EGF、E2进行了比较实验,以hoechest染色核物质达到MII期作为卵母细胞成熟的判断标准。结果显示:联合添加EGF和E2,体外培养成熟率高于单独添加组和对照组（22.58% vs 18.00%, 5.56%, 4.76%）;添加20%的FBS,其卵成熟率与添加20%的EDS无显著差异（17.14% vs 17.95% ）,但均显著高于对照组（0%）;EGF对卵丘有扩展作用,其卵丘扩展率与成熟率相关,但EGF的浓度并不与成熟率呈正线性相关;在体外培养的时间以72h为优,卵丘细胞对成熟率有重要作用,COCs组成熟率明显高于去颗粒细胞组（15.56% vs 3.13%）。NR2B蛋白与哺乳动物的突触性、学习记忆、痛觉、神经系统疾病有关,因此有必要建立NR2B转基因高等动物模型来进一步研究该亚单位的作用。本实验室正承担着NR2B转基因犬的构建项目,故本实验将为该项目的进行提供NR2B慢病毒,用其高效感染胚胎获得转基因犬。在本研究中,我们采用脂质体共转染的方法,在293T细胞中生产NR2B慢病毒,并采取超速离心的方法,对收获的慢病毒颗粒进行浓缩、纯化和滴度测定,获得病毒最高滴度达1.2×108TU/ml;将生产的慢病毒感染PC12细胞,经抗性筛选得到稳定传代细胞,提取其RNA,经RT-PCR能检测到目的片段,采用Western blotting进一步验证,成功表达NR2B蛋白,说明该慢病毒可携带NR2B基因转入PC12,并稳定表达NR2B蛋白。这为该慢病毒在犬胚胎上的转染和最终表达提供了一定依据。总之,本研究在体外成功培养的成熟卵母细胞和经生产鉴定的慢病毒,都为我们的后续工作—NR2B转基因犬的构建奠定了良好的基础。