论文摘要
血吸虫病是一种危害严重的人畜共患病,广泛分布于世界各地。在我国流行的主要是日本血吸虫病。几十年来我国主要利用灭螺,环境改造,健康教育,以及药物治疗等技术措施来防控血吸虫病,取得了显著的成效。目前在我国仍有7个省流行血吸虫病。仅靠这些综合措施和单一的药物治疗难以彻底消灭血吸虫病,因此加强血吸虫疫苗的开发和新药物的研究无疑是血吸虫病防治的重要措施。本研究在参考SmCaspase9勺基因序列,设计特异性引物应用PCR技术获得SjCaspase9的全长cDNA序列。生物信息学分析,ORF长度为1140bp,编码380个氨基酸。Caspase9是凋亡通路中很重要的一个凋亡蛋白,能够促进机体的组织器官发生凋亡。本研究以Sjcaspase9为研究对象,开展了该基因的克隆、表达以及重组蛋白免疫保护效果的研究,为深入探讨SjCaspase的生物学功能,评估其作为疫苗候选分子和药靶的应用前景提供了基础。本实验室前期开展了不同宿主来源虫体基因的差异表达分析,发现血吸虫在易感宿主小鼠,非易感宿主大鼠和血吸虫抗性宿主的东方田鼠三者来源虫体之间存在基因的差异表达。基因Caspase9就是这些差异表达基因中的一种。成功地构建了重组表达质粒pET-28a-SjCaspase9,重组蛋白在E.coli（DE3）中以包涵体形式存在,分子量为44kDa。Western blotting分析表明重组蛋白具有好的抗原性。提取7d、14d、21d、28d、35d、42d和42d雌雄各个时期的虫体蛋白,以α-tublin为内参,通过Western blotting检测各个时期虫体中Caspase9蛋白的表达情况。以看家基因α-tublin为内参,应用荧光定量PCR技术分析SjCaspase9在大鼠,小鼠,东方田鼠收集虫体和小鼠收集不同期别的虫体中的转录情况。证明该基因在7d,14d,21d,28d,35d,42d虫体都有表达,其中7d的的表达量最高,雌虫表达量高于雄虫。该基因在东方田鼠,大鼠,小鼠10d童虫中也均有表达,东方田鼠的10d童虫表达量最高,大鼠次之,小鼠10d童虫的表达量最低。Caspase9的高表达可能与虫体发育过程中部分器官退化相关。本研究还构建了pcDNA3.1（+）-caspase9重组表达质粒,并转染到Hela细胞发现重组质粒在该细胞中能够表达,用流式细胞术对转染细胞凋亡现象进行了分析。用纯化的pET-28a-SjCaspase9重组蛋白免疫BALB/c小鼠,结果与空白对照组相比,重组蛋白pET-28a-SjCaspase9在小鼠中诱导了26.44%的减虫率和32.98%的肝脏减卵率,差异显著（p<0.05）。ELISA方法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平变化。结果表明,重组蛋白可诱导小鼠体内特异性IgG抗体迅速产生,并且维持在一个较高的水平。本研究为深入研究SjCaspase9基因的生物学功能奠定了基础,为筛选新的血吸虫病疫苗候选分子和药物靶标提供了新思路。