苏云金芽胞杆菌SigL和sRNA功能的生物信息分析

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus.thuringiensis）是目前应用最广泛的微生物杀虫剂。在形成芽胞的同时,B. thuringiensis还大量表达杀虫晶体蛋白并将其组装成伴胞晶体,相关的调控机制一直是研究的热点和难点。sigL基因编码的产物SigL是细菌中调控许多重要代谢途径的6因子。到目前为止,几乎在所有物种中都鉴定到了非编码RNA作为基因表达的调节因子,对基因的转录、翻译起到复杂的抑制或者激活作用,而B. thuringiensis sRNA的研究目前还是空白。本研究对B. thuringiensis YBT-1520的SigL及其增强子结合蛋白（bacterial enhancer binding protein, bEBP）的结构和功能进行了分析；在基因组水平阐释了YBT-1520和BMB171菌株的sRNA的种类和功能。取得的主要成果如下：1)YBT-1520菌株SigL及其bEBP的结构和功能的生物信息学分析YBT-1520菌株基因组中存在1个SigL和6个bEBP,而且bEBP在结构上具有丰富的多样性,包含了bEBP的所有可能的结构域组织类型。SigL所调控的基因涉及11个COG功能类群,其中包括能量代谢、氨基酸代谢、翻译与细胞周期等。根据bEBP在基因组的位置推测,YBT-1520中bEBP参与γ-氨基丁酸代谢途径、精氨酸代谢途径、支链脂肪酸降解途径、多糖分解代谢等代谢途径的调控。2)YBT-1520菌株bEBP与PspA相互作用的验证用细菌双杂交的方法研究了YBT-1520中的bEBP与噬菌体休克蛋白（phage-shock protein, PspA）之间的两两相互作用关系。在已完成的2个bEBP和2个PspA之间,Bt1520GL001560和Bt1520GL000962有强烈的相互作用,其他组合互作关系不明显。结果提示,YBT-1520中bEBP与PspA的相互作用关系可能更复杂,且不同于Escherichia coli中的PspA和PspF类似的调控关系。3)YBT-1520和BMB171基因组sRNA的分析和功能预测YBT-1520基因组中共预测到575条sRNA,其中18条为rRNA或tRNA,441条反式编码的反义sRNA （trans-encoded antisense RNAs）、26条功能已知的核酸开关（riboswitch）、90条功能未知的潜在核酸开关,这些潜在的核酸开关可能与17个COG功能类群密切相关。BMB171基因组中共预测到576条sRNA,其中30条为rRNA或tRNA、402条反式编码的反义sRNA、25条功能已知核酸开关、119条是功能未知的潜在核酸开关,这些潜在的核酸开关可能与信号转导、细胞膜的形成、蛋白翻译后修饰、转运、碳代谢、能量代谢、脂类代谢等18个COG功能类群相关。综上所述,本研究通过多种生物信息分析手段的综合运用并结合部分实验验证,开展了B. thuringiensis SigL和sRNA的结构和功能研究。本研究将为深入分析B. thuringiensis伴胞晶体和芽胞形成过程中物质和能量代谢的变化提供重要依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 苏云金芽胞杆菌SigL的功能研究
• 1.1 前言
• 1.1.1 Sigma因子分类
• 54家族的作用机制'>1.1.2 σ⁵⁴家族的作用机制
• 54的细菌增强因子结合蛋白和噬菌体休克蛋白'>1.1.3 依赖于σ⁵⁴的细菌增强因子结合蛋白和噬菌体休克蛋白
• 54调控的基因的生理功能'>1.1.4 受σ⁵⁴调控的基因的生理功能
• 1.1.5 立题依据
• 1.1.6 目的与意义
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 菌株与质粒
• 1.2.2 主要试剂
• 1.2.3 培养基与溶液
• 1.2.4 实验仪器
• 1.2.5 YBT-1520中SigL和bEBP的结构和功能的生物信息分析
• 1.2.5.1 序列来源
• 1.2.5.2 YBT-1520中SigL和bEBP结构分析
• 1.2.5.3 YBT-1520中SigL和bEBP功能分析
• 1.2.6 细菌双杂交实验
• 1.2.6.1 细菌双杂交系统
• 1.2.6.2 YBT-1520总DNA提取
• 1.2.6.3 目的基因扩增
• 1.2.6.4 质粒构建
• 1.2.6.5 共转化和筛选
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 苏云金芽胞杆菌σ因子差异比较
• 1.3.2 YBT-1520中SigL的鉴定和SigL转录基因的生物信息分析
• 1.3.3 SigL转录基因的COG功能分类
• 1.3.4 8株芽胞杆菌菌株中bEBP数量和结构分析比较
• 1.3.5 YBT-1520中6个bEBP的结构域
• 54互作结构域详细分析'>1.3.6 YBT-1520中6个bEBP的σ⁵⁴互作结构域详细分析
• 1.3.7 YBT-1520中6个bEBP功能分析
• 1.3.8 YBT-1520中SigB和RsbW相互作用的研究
• 1.3.8.1 sigB和rsbW基因的克隆
• 1.3.8.2 细菌双杂交表达载体的构建与鉴定
• 1.3.8.3 质粒pBT-sigB和pTRG-rsbW共转化细菌双杂交报告菌株
• 1.3.8.4 细菌双杂交结果分析
• 1.3.9 YBT-1520中bEBP与PspA的蛋白质相互作用的实验验证
• 1.4 讨论
• 1.4.1 细菌双杂交系统在σ因子和抗σ因子相互作用研究中的应用
• 1.4.2 YBT-1520中SigL和bEBP结构和功能研究
• 1.5 小结
• 第二章 苏云金芽胞杆菌sRNA功能研究
• 2.1 前言
• 2.1.1 原核sRNA研究进展
• 2.1.2 反义RNA研究进展
• 2.1.2.1 顺式编码的反义sRNA
• 2.1.2.2 反式编码的反义sRNA
• 2.1.2.3 Hfq的功能
• 2.1.2.4 顺式编码反义sRNA和反式编码反义sRNA的不同之处
• 2.1.3 蛋白结合的sRNA
• 2.1.4 核酸开关的研究进展
• 2.1.4.1 核酸开关结构
• 2.1.4.2 核酸开关调控基因表达的机制
• 2.1.5 CRISPR的研究进展
• 2.1.5.1 CRISPR系统的基本结构
• 2.1.5.2 CRISPR的作用机理
• 2.1.6 立题依据
• 2.1.7 目的与意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 本文采用的数据
• 2.2.2 sRNA预测方法
• 2.2.3 sRNA靶基因的预测
• 2.2.4 功能已知核酸开关的预测
• 2.2.5 功能未知核酸开关的预测
• 2.2.6 CRISPR的预测方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 基因组sRNA的预测结果
• 2.3.2 已知核酸开关的预测和比较功能分析
• 2.3.3 未知核酸开关的预测和比较功能分析
• 2.3.4 基因组小的新ORF预测结果
• 2.3.5 YBT-1520和CT-43质粒CRISPR的比较分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 YBT-1520中microRNA的分析方法
• 2.4.2 miRNA表达谱构建
• 2.4.3 样品间已知miRNA成熟体差异分析
• 2.4.4 已知miRNA成熟体比对到基因组预测前体
• 2.4.5 miRNA的结构分析
• 2.5 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间发表的论文