AngⅡ对心室肌细胞Ikr电流的调节及其信号传导机制

论文摘要

心肌肥厚、心衰是冠心病、高血压、心瓣膜病等多种心血管病的常见合并症。心肌肥厚、心衰时发生病理性电生理重构使得心脏的电生理不稳定性增加,常常伴发心律失常,心衰病人约一半以上因恶性心律失常的发生而猝死（即心性猝死Sudden cardiac death, SCD）。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）是由肾素、血管紧张素以及其受体构成的重要体液系统,在调节心血管系统的正常生理功能与高血压、心肌肥大、充血性心力衰竭等诸多心血管的病理过程中具有重要作用。RAS不仅存在于体液系统,而且在包括心脏、血管在内的许多组织中也有RAS,在局部调节生理病理过程。血管紧张素II（Ang II）是其该系统发挥作用的主要体液因子,其受体有1型（AT1）和2型（AT2）两种。近几年大规模的临床试验研究发现,通过血管紧张转化酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI）抑制Ang II的合成或AT1受体阻断剂可能因减少致命性心律失常的发生而明显降低病人死亡率。实验表明,抑制RAS可有效治疗缺血再灌诱发的心律失常。ACE抑制剂和AT1受体阻断剂成为目前临床高血压、心衰病人治疗的重要药物。然而,这些药物潜在抗心律失常的机制尚不清楚。正常心脏电活动取决于各种离子有序的跨膜转运,先天遗传基因改变或后天获得性因素（如心脏病理性变化、药物等）均可引起离子通道功能紊乱,构成了心律失常的物质基础。心肌肥厚、心衰时最突出的表现是心肌细胞复极化过程变慢,而导致动作电位的延长,为细胞产生后除极、尖端扭转性室速等心律失常创造了前提条件。心肌复极钾电流存在明显的种属差别。大动物、人的复极化钾电流主要是Iks和Ikr。目前认为,人心肌中Ikr由HERG（human ether-a-go-go-related gene）基因编码,HERG通道的激活引发动作电位3期复极的开始,对心肌的复极化有至关重要的作用。由于HERG基因突变或药物诱导的Ikr阻断减少心脏HERG电流,分别产生与7号常染色体有关的先天性LQTS和获得性LQTS,这两种LQTS的形成都与延迟心脏复极,延长体表心电图的QT间期,有较高的尖端扭转型室性心律失常和猝死的危险。最近的实验表明一些G蛋白偶联受体如α-和β-肾上腺素受体通过细胞内第二信使如cAMP,PKA和PKC调节HERG通道。然而,迄今为止Ang II对心室细胞复极过程起重要作用的Ikr的影响尚了解甚少。故本研究利用膜片钳技术,在急性分离的豚鼠心室肌细胞和异源表达系统上观察了Ang II对kr/HERG电流的影响,并分析了中介Ang II作用的细胞内信号途经,为病理情况下心律失常发生的分子机制及解释ACEI、AT1受体阻断剂的药效提供实验依据。第一部分表达HERG蛋白稳定细胞株的建立及其鉴定目的:建立稳定表达HERG通道蛋白的HEK293细胞株。方法:用Lipofectin 2000转染试剂将HERG基因转染到HEK293细胞,经G418筛选,用荧光显微镜,Western Blot和全细胞膜片钳技术检测HERG基因在HEK293细胞中的稳定表达情况。结果:G418筛选,培养4周阳性克隆形成。荧光显微镜,Western Blot和全细胞膜片钳技术检测,证实HERG基因得到了稳定表达并记录到了转染成功的HERG电流,通过HERG通道对其特异性阻断剂E-4031的IC50,进一步表明在HEK细胞上正常HERG通道蛋白表达。结论:建立了稳定表达HERG基因的HEK293细胞株,表达的HERG蛋白能形成有功能的通道,产生HERG电流。第二部分Ang II作用于AT1受体抑制心室肌细胞的快速延迟整流钾（Ikr）电流目的:观察Ang II对豚鼠心室肌细胞Ikr的影响。方法:在急性分离的豚鼠心室肌细胞及共表达HERG和人Ang II AT1受体基因的HEK293细胞上,全细胞膜片钳技术记录Ikr/HERG电流,观察Ang II对电流影响。结果:Ang II以浓度依赖的方式抑制Ikr,IC50是8.9 nM。Ang II （100 nM）延长心室肌细胞动作电位APD50和APD90,分别延长20%和16%。AT1受体阻断剂losartan（1μM）完全取消AngII对Ikr电流的抑制作用。在共表达HERG和AT1受体基因的HEK293细胞上,Ang II也抑制HERG电流,减慢通道的激活、去活和再恢复。PKC抑制剂stausporine和Bis-1明显减弱Ang II对Ikr电流的抑制作用。结论:Ang II作用于AT1受体,经过PKC途经抑制心室肌细胞的Ikr电流。这对解释病理情况下,如心肌肥厚心衰时,Ang II的升高导致心律失常的发生提供了一个可能的机制。第三部分Ang II通过PKCε亚型抑制Ikr/HERG电流目的:分析中介Ang II抑制Ikr/HERG电流的PKC亚型及其下游分子机制。方法:在急性分离的豚鼠心室肌细胞及共表达HERG和人Ang II AT1受体基因的HEK293细胞上,观察选择性PKC抑制剂、激动剂及PKC亚型转位抑制肽对Ang II作用的影响,分析中介其作用的PKC亚型;观察HERG通道磷酸化位点突变对Ang II作用的影响,分析PKC下游的分子机制。结果:在HEK293细胞上,应用PKC抑制剂stausporine和Bis-1明显减小了Ang II对HERG电流的抑制作用;长期孵育PMA下调PKC也明显减小了Ang II对HERG电流的抑制作用。细胞内钙螯合剂浓度增加不影响Ang II抑制HERG电流。特异性亚型PKC抑制剂G?-6976和G?-6983不影响Ang II对HERG电流的抑制作用;PKCε亚型的转位抑制剂明显对抗Ang II对HERG电流的抑制作用。在豚鼠心室肌细胞上,PKCε亚型的转位抑制剂明显减小Ang II对Ikr的抑制作用。HERG通道的磷酸化位点突变后,几乎取消了Ang II对HERG电流的抑制作用。结论:（1）Ang II主要通过PKCε的激活抑制Ikr/HERG。（2）Ang II通过PKCε使HERG通道蛋白磷酸化,调节HERG通道的功能。结论1.本研究建立了表达HERG基因的稳态HEK293细胞株,表达的蛋白能形成有功能的通道,产生HERG电流。2. Ang II作用于AT1受体,经过PKC途经抑制心室肌细胞的Ikr电流。这对解释病理情况下,如心肌肥厚心衰时,Ang II的升高导致心律失常的发生提供了一个可能的机制。3. Ang II主要通过PKCε的激活抑制Ikr/HERG。4. Ang II有可能通过PKCε使HERG通道磷酸化,调节HERG通道的功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 AngII 对心室Ikr 的调节及其信号传导机制
• 引言
• 第一部分 稳定表达HERG通道蛋白的HEK293 细胞株的建立及其鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 AngII 抑制心室肌细胞的 Ikr/HERG 电流
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 AngII 通过 PKCε 亚型调节 Ikr/HERG 电流
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 心脏 Ikr/HERG 通道与心律失常
• 致谢
• 个人简历