艾丁湖沉积物放线菌多样性研究

论文摘要

盐环境中的放线菌不仅能产生多种抗生素,还能产生多种耐盐胞外酶,其中耐盐淀粉酶、耐盐核酸酶、耐盐蛋白酶等有广阔的应用前景。盐环境中的放线菌产生的四氢嘧啶和甜菜碱是高效的保护剂,又是酶类、核酸、细胞膜的稳定剂,在酶技术、医药工业和环境保护领域有重要的应用价值。研究盐环境中的放线菌多样性,能促进放线菌资源开发,有利于新物种和新产物的发现。位于新疆吐鲁番盆地南部的艾丁湖具有低海拔、高盐度的特点。本研究采集艾丁湖沉积物样品,应用基于16S rDNA基因序列系统发育分析的免培养方法和选择性分离培养方法揭示放线菌多样性,以期获得艾丁湖放线菌物种资源,为开发利用提供技术支撑和菌种支持。(1)利用放线菌特异性引物扩增16S rDNA基因,构建16S rDNA基因克隆文库,对文库中的克隆片段进行RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性片段长度多态性)分析。研究分析表明:273个克隆分布于放线菌纲(Actinobacteria)的三个亚纲中,即放线菌亚纲(Actinobacteridae 208个)、酸微菌亚纲(Acidimicrobidae 13个)和红色杆菌亚纲(Rubrobacteridae 52个)。优势放线菌为放线菌亚纲微球菌科的罗斯氏菌属(Rothia),占克隆总数的37%。有45.8%的序列与已有效发表菌株的序列相似性小于97%,部分序列形成了几个独立的进化分支,可能代表着放线菌新的类群。(2)采用不同盐浓度的9种选择性培养基分离放线菌,共得到55株放线菌,分布在放线菌目的6个亚目中,以链霉菌属(Streptomyces)和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)为主要类群。还分离到一些放线多孢菌属(Actinopolyspora)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、疣孢菌属(Verrucosispora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)和微球菌属(Micrococcus)的稀有放线菌。有3株放线菌的16S rDNA基因序列与已有效发表菌株的序列最大相似度小于97%,为潜在的放线菌新分类单元。(3)对2株为潜在新种的放线菌进行了多相分类,结果表明,菌株TRM46004为Streptoalloteichus属的新种,菌株TRM46012为Streptomyces属的新种。综合分析免培养和分离培养结果,表明艾丁湖放线菌具有较高的多样性,并蕴藏着多种新类型,有进一步研究价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 盐环境中放线菌的研究意义
• 1.2 放线菌的多样性研究
• 1.2.1 纯培养方法
• 1.2.2 免培养方法
• 1.2.2.1 PCR-RFLP 方法
• 1.2.2.2 PCR-SSCP 方法
• 1.2.2.3 DGGE 与TGGE 方法
• 1.2.2.4 RAPD 方法
• 1.3 盐环境中放线菌的分离
• 1.4 放线菌的多相分类
• 1.4.1 表型信息
• 1.4.1.1 细胞化学组分分析
• 1.4.1.2 磷酸类脂分析
• 1.4.1.3 醌组分分析
• 1.4.1.4 全细胞脂肪酸分析
• 1.4.2 基因型和系统发育信息
• 1.4.2.1 DNA 碱基组成比例
• 1.4.2.2 DNA-DNA 分子杂交
• 1.4.2.3 16S rDNA 基因序列分析
• 1.5 论文的设计思路
• 1.5.1 设计思路
• 1.5.2 研究方案
• 1.5.3 技术路线
• 第二章 艾丁湖免培养放线菌多样性研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 样品的采集
• 2.1.1.2 主要试剂和仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 样品组分的测定
• 2.1.2.2 样品总DNA 的提取
• 2.1.2.3 放线菌特异性序列的扩增
• 2.1.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.2.5 回收纯化
• 2.1.2.6 连接T 载体
• 2.1.2.7 转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.1.2.8 构建克隆文库
• 2.1.2.9 克隆文库的检验及RFLP 分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 沉积物样品盐离子组分的测定结果
• 2.2.2 免培养方法分析艾丁湖沉积物放线菌多样性
• 2.2.2.1 沉积物总DNA 的提取及放线菌特异性序列的扩增
• 2.2.2.2 克隆文库的构建
• 2.2.2.3 克隆文库的检验及放线菌多样性指数分析
• 2.2.2.4 艾丁湖免培养放线菌多样性分析
• 2.3 讨论
• 第三章 艾丁湖可培养放线菌多样性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 分离培养方法
• 3.1.1.1 稀释涂布平板法
• 3.1.1.2 培养基
• 3.1.2 放线菌种类的初步鉴定
• 3.1.2.1 放线菌基因组DNA 的提取
• 3.1.2.2 放线菌16S rDNA 基因的扩增
• 3.1.2.3 测序结果的比对分析
• 3.1.2.4 放线菌菌种的保藏
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 艾丁湖沉积物可培养放线菌的多样性
• 3.3 讨论
• 第四章 两株潜在放线菌新种的多相分类
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 分子生物学鉴定
• 4.1.1.1 16S rDNA 基因的克隆测序
• 4.1.1.2 依据16S rDNA 基因序列进行系统发育分析
• 4.1.1.3 放线菌基因组DNA （G+C）%含量的测定
• 4.1.2 形态学特征
• 4.1.3 生理生化特征
• 4.1.3.1 碳源利用
• 4.1.3.2 淀粉水解
• 4.1.3.3 牛奶凝固与胨化
• 4.1.3.4 明胶液化
• 4.1.3.5 纤维素分解利用
• 4.1.3.6 硝酸盐还原
• 4.1.3.7 硫化氢产生
• 4.1.3.8 氧化酶产生
• 4.1.3.9 过氧化氢酶产生
• 4.1.3.10 尿素酶产生
• 4.1.3.11 脂酶试验
• 4.1.3.12 温度耐受及最适生长温度的确定
• 4.1.3.13 盐度耐受及最适生长盐浓度的确定
• 4.1.3.14 pH 耐受及最适生长pH 的确定
• 4.1.4 细胞化学组分分析
• 4.1.4.1 全细胞糖组分分析
• 4.1.4.2 全细胞氨基酸组分分析
• 4.1.4.3 磷酸类脂分析
• 4.1.4.4 脂肪酸分析
• 4.1.4.5 醌组分的测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 分子特征鉴定结果
• 4.2.1.1 系统发育分析
• 4.2.1.2 （G+C）%含量测定结果
• 4.2.2 形态特征
• 4.2.3 生理生化指标测定结果
• 4.2.3.1 碳源利用实验结果
• 4.2.3.2 温度耐受实验结果
• 4.2.3.3 NaCI 耐受实验结果
• 4.2.3.4 pH 耐受试验结果
• 4.2.3.5 酶学特征实验结果
• 4.2.3.6 代谢实验结果
• 4.2.4 细胞化学组分分析结果
• 4.2.4.1 全细胞糖组分和DAP 测定结果
• 4.2.4.2 磷酸类脂分析结果
• 4.2.4.3 脂肪酸分析结果
• 4.2.4.4 醌组分的测定结果
• 4.2.5 与相近菌株的比较
• 4.2.5.1 菌株TRM46004 与相近菌株的比较
• 4.2.5.2 菌株TRM46012 与相近菌株的比较
• 4.3 讨论
• 第五章总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介