淋巴结组织成分对小鼠肝癌细胞高、低转移株转移能力的影响

论文摘要

肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系。它不仅与肿瘤细胞自身的（核和胞质）内在环境有关，而且亦与肿瘤所在组织的结构、功能和代谢密切相关。长期以来，对肿瘤细胞侵袭和转移机制的研究主要集中在细胞本身遗传及表观遗传改变而发生的自身黏附性及迁移能力变化。然而，近年来大量研究提示肿瘤的微环境在促进肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要作用。肿瘤微环境对于肿瘤发生、发展以及转移的的重要作用已经日益被重视。肿瘤微环境与肿瘤细胞共同构成一个微型系统，因此利用系统生物学的观点和方法来研究肿瘤的转移机制是更有效和更科学的。Hca-F和Hca-P细胞属于同源筛选出的遗传背景相同，而转移表型不同的一对具有高低不同淋巴道转移潜力的细胞株，它们对于研究肝癌淋巴道转移机制是非常好的细胞模型。目的：本研究利用淋巴结组织匀浆中全部非细胞成分模拟淋巴结转移微环境中的非细胞分成，分别与具有高、低淋巴道转移潜力的肝细胞癌细胞株Hca-F细胞和Hca-P细胞共同孵育，在体外模拟肝癌细胞转移到淋巴结组织时所处的微环境，从而探索淋巴结组织成分对于Hca-F和Hca-P细胞的侵袭和转移能力，蛋白质表达以及microRNA的影响，进而探讨肝癌细胞淋巴结转移的分子机制，以期为肝癌细胞淋巴结转移的诊断提供依据，为治疗提供新的潜在靶点。方法：1.侵袭和转移能力检测：检测二细胞株在淋巴结孵育前后的的过膜迁徙能力、IV型胶原蛋白酶（MMP-2, MMP-9）的分泌能力。1.1明胶酶谱法：无菌条件下取出小鼠淋巴结匀浆与肝癌高转移株Hca-F细胞和低转移细胞株Hca-P细胞于37℃，5%CO2条件下共同孵育24小时后，收集培养液，离心；取上清液40μl上样在分离胶为7.5%聚丙烯酰胺（含0.5%明胶）内，恒压100V，4℃电泳1.5h；电泳结束后，取出凝胶使用2.5%TritonX-100在摇床上振荡洗脱，漂洗，37℃孵育24h；经考马斯亮蓝染色，脱色后，显示出MMP-2（72KD）和MMP-9（92KD）的透明亮带。利用Gel-Pro analyzer（灰度分析）软件进行凝胶图像处理和分析。1.2过膜迁徙能力（Transwell）：将等量Hca-F和Hca-P细胞加在transwell上面的小室里，小室下面分别加入含有不同浓度淋巴结匀浆的RPMI1640培养液和含10%FBS的RPMI1640（对照组）0.6mL；孔板置于培养箱中37oC，5%CO2条件下培养18小时；终止培养并彻底清除上室中细胞及培养液；将Transwell膜下面的细胞固定、染色，然后利用可拍照的显微镜拍照直接记数；利用SPSS version19.0统计分析软件对穿过Transwell膜的细胞数进行Student’s t-test和ANOVA分析。2.2-DE/MS联用技术检测差异蛋白：常规方法裂解细胞后，提取细胞内全部蛋白质成分；7cm IPG干胶条于含有600μg细胞总蛋白水化液中室温水化后，20°C下进行等点聚焦；聚焦好的胶条进行平衡；在10°C下进行二向垂直板电泳；电泳结束后银染；获取图像；数字化图象用PDQuestTM8.0软件分析；确定要检测的差异蛋白点，进行蛋白质消化；质谱点样；进行质谱分析；最后进行质谱数据检索。3. Western blotting分析：裂解细胞，提取细胞全蛋白；进行常规SDS-PAGE电泳；半干法转膜；洗膜后，1%BSA室温封闭；一抗4oC过夜孵育；二抗室温孵育1小时ECL化学发光检测；X光片上的条带，用Gel-Pro Analyzer4.0进行分析。4. MicroRNAs Arrary分析：Trizol法分别提取淋巴结匀浆处理前后Hca-F细胞中总RNA，然后用试剂盒纯化得到MicroRNAs，使用Affymetrix miRNA1.0Array分析样品。结果：1.凝胶酶谱实验显示：与淋巴结匀浆共同孵育24小时后，肝癌高转移细胞株Hca-F分泌MMP-2和MMP-9有显著的增加，分别是对照组细胞的5.2倍（p<0.01）和4.8倍（p<0.01）；而与淋巴结匀浆孵育后肝癌低转移细胞株Hca-P分泌的MMP-2和MMP-9增加并不明显。1. Transwell迁移实验结果表明：分别与0.15mg/mL，1.5mg/mL和15mg/mL淋巴结组织匀浆共同孵育18小时后，Hca-F细胞在细胞迁移的数量分别是对照组的2.4（p <0.05），5.5（p <0.05）和8.0（p <0.01）倍，而且细胞迁移数量与淋巴结组织匀浆的浓度成正相关；各处理组Hca-P细胞迁移的数量与未孵育组相比较都增加约2.7倍，细胞增加数量与淋巴结组织匀浆的浓度无明显相关性。2.2-DE/MS联用技术检测差异蛋白结果显示：Hca-F细胞与淋巴结匀浆共同孵育24小时后，细胞全蛋白中共有49个蛋白上调，74个蛋白下调；质谱鉴定出的7个蛋白质，通过文献检索，其中4个蛋白功能明确：半乳糖凝集素3（GAL-3）、二氢硫辛酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶和葡萄糖调节蛋白（GRP78）；其中下调的二氢硫辛酸脱氢酶是糖有氧代谢中三羧酸循环的限速酶组成成分，上调的磷酸丙糖异构酶是参与糖酵解的酶；与肿瘤细胞转移相关的蛋白GRP78上调，GAL-3下调。3. Western blotting分析：淋巴结匀浆诱导24小时后，GRP78在Hca-F细胞中是对照组的2.4倍（p<0.05），在Hca-P细胞中大约是对照组的一半（p<0.05）；而GAL3的变化则相反，在Hca-F细胞中约为对照组细胞的一半（p<0.05），而在Hca-P细胞中则略较对照组多。4. MicroRNAs Arrary分析：在Hca-F细胞与淋巴结组织匀浆共同孵育后，共有33种microRNAs表达发生改变，其中抑制肿瘤的生长和转移、促进凋亡的miR-101发生下调，而促进肿瘤生长和转移的miR-17-5P发生上调。结论：淋巴结匀浆分别与具有高、低淋巴结转移潜力的肝细胞癌细胞株Hca-F细胞和Hca-P细胞共同孵育后，Hca-F细胞的侵袭、跨膜迁移能力明显增强，蛋白表达向有利于肿瘤转移的方向转变；而Hca-P细胞的侵袭、跨膜迁移能力则变化较小，蛋白表达变化不显著或向不利于转移的方向变化。这些证据表明高转移潜力细胞暴露在某些组织环境中，会与组织微环境相互作用，调节自身蛋白表达从而适应环境变化，这也从分子水平解释Hca-F细胞和Hca-P细胞在肝癌转移的动物模型中具有相反的转移表型；同时也证明淋巴结组织成分作为肿瘤转移过程中的微环境成分，对于肿瘤细胞的转移相关因子具有诱导作用；本研究发现的在高低转移株细胞中具有不同变化趋势的两个蛋白质——GRP78和Galectin-3具有成为肝细胞癌淋巴结转移诊断的潜在生物标志物的可能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 淋巴结匀浆对小鼠肝癌细胞高、低转移株侵袭能力的影响
• 材料和方法
• 1. 材料
• 1.1 动物和细胞
• 1.2 试剂和仪器
• 2. 方法
• 2.1 肿瘤细胞培养
• 2.2 淋巴结组织匀浆
• 2.3 凝胶酶谱法检测 MMP-2 和 MMP-9
• 2.4 细胞迁移实验
• 结果
• 1. 淋巴结匀浆增加细胞 MMP-2 和 MMP-9 分泌
• 2. 淋巴结匀浆增强细胞在体外的迁移能力
• 讨论
• 总结
• 第二部分 淋巴结匀浆对小鼠肝癌细胞高、低转移株转移相关蛋白的影响
• 材料和方法
• 1. 材料
• 1.1 动物和细胞
• 1.2 试剂和仪器
• 2. 方法
• 2.1 细胞全蛋白提取和纯化
• 2.2 双向电泳
• 2.3 MALDI-TOF 质谱分析
• 2.4 Western blot 分析
• 2.5 统计学分析
• 结果
• 1. 淋巴结匀浆改变 Hca-F 细胞蛋白表达谱
• 2. Western blot 分析
• 讨论
• 总结
• 第三部分 淋巴结匀浆对小鼠肝癌细胞高、低转移株转移相关蛋白的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢