论文题目: GPMVF、HN及NP基因的多表达系统与DNA疫苗的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 杨玉菊
导师: 王君伟
关键词: 鹅副粘病毒,基因,基因,基因,原核表达,重组禽痘病毒转移载体,疫苗
文献来源: 东北农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 1997 年以来,在我国许多地区爆发了由鹅副粘病毒(Goose Paramyxovirus,GPMV)引起的鹅的烈性传染病。该病是以消化道和呼吸道病变为主要特征,具有高度的发病率和死亡率,给养鹅业带来了严重的危害。目前,临床上对GPMV 感染尚无特效的治疗药物,接种疫苗是预防和控制该病发生的主要手段和途径。应用传统的活疫苗如LaSota、C30 等由于其基因型不同(传统的疫苗属于基因Ⅱ型、Ⅲ型,而GPMV 属于基因Ⅶ型),因而造成疫苗只能起到部分的保护作用。目前应用的油乳灭活苗对该病起到了一定的控制作用,但由于灭活苗在灭活过程中造成抗原表位的缺失或抗原性减弱,而不能产生足够的保护水平,以至于需要重复接种,使用很不方便,并且灭活苗免疫不能产生细胞内源性蛋白,因而不能诱导细胞毒性T 细胞(CTL)的产生,而CTL 是真正有效的免疫效应细胞,在抗病毒中起着重要的作用。随着分子免疫学、分子病毒学和分子生物学等相关技术的发展,如何利用基因工程技术生产基因工程疫苗来预防和控制该病成为一项迫在眉睫的问题。本研究首先通过RT-PCR 技术成功的扩增了GPMV 的三段主要保护性抗原基因,并进行了克隆、序列的测定与分析。结果表明:(1)GPMV JS/1/97/Go 分离株F 基因由ATG 到TGA共1662 个核苷酸,编码553 个氨基酸残基;有6 个潜在的糖基化位点;F 蛋白裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的特征;具有基因ⅦNDV 的典型特征,即101 位和121位分别为K(赖氨酸)和V(缬氨酸)两个特征性氨基酸;与其它10 个国内外参考毒株的核苷酸的同源性为83.8%-97.9%,推导氨基酸的同源性为87.3%-97.3%。(2)HN 基因的ORF为1716 个核苷酸,编码571 个氨基酸;有5 个潜在糖基化位点;12 个保守的半胱氨酸(Cys)残基;与其它9 个国内外参考毒株的核苷酸的同源性为82.4%-98.5%,推导氨基酸的同源性为88.4%-98.1%。(3)NP 基因由起始密码子到终止密码子共1470 个核苷酸,编码489 个氨基酸残基,有4 个保守的半胱氨酸残基;与其它9 个国内外参考毒株的核苷酸的同源性为85.2%-98.6%,推导氨基酸的同源性为90.8%-99.6%。本实验首先将克隆到pMD18-T 的NP 基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P 的多克隆位点中,构建表达GPMV NP 基因的原核表达载体pGEX-6P-NP。接下来将GPMV 的F 和HN分别亚克隆到含有禽痘病毒早/晚启动子LP2EP2的pSY538 载体的EcoRⅠ酶切位点上,然后分别通过SmaⅠ或XbaⅠ酶切位点将带有P11 启动子的LacZ 基因也克隆到此载体上,最后将F 和LacZ 基因、HN 和LacZ 分别克隆到pSY681 载体NotⅠ位点上,从而成功的构建了分别含有GPMV F、HN 基因的重组禽痘病毒转移载体,分别命名为pSY681-F-LacZ 和pSY681-HN-LacZ;为了构建双基因的转移载体,将带有LP2EP2 启动子的F 基因亚克隆到前面已构建好的pSY681-HN-LacZ 载体的XhoⅠ位点上,即得到同时含有F 和HN 的双基因重组禽痘病毒转移载体。最后将GPMV 能诱导宿主产生保护性免疫反应的主要抗原基因F、HN和NP 作为候选基因,以具有CMV 的启动子真核表达载体pcDNA3.1+作为载体,构建了含有以上三种基因的DNA 疫苗。将pGEX-6P-NP 阳性重组子转染于大肠杆菌BL21 中,经IPTG 诱导,由SDS-PAGE 电
论文目录:
摘要
ABSTRACT
1 引言
1.1 鹅副粘病毒病的研究进展
1.1.1 鹅副粘病毒的生物学性状
1.1.2 GPMV 的分子生物学特征
1.1.3 GPMV 病的防治
1.2 DNA 疫苗的研究进展
1.2.1 DNA 疫苗的组成与分类
1.2.2 DNA 疫苗的免疫机制
1.2.3 DNA 疫苗的特点
1.2.4 影响DNA 疫苗免疫效果的因素
1.2.5 DNA 疫苗研究需要解决的几个问题
1.2.6 APMV 病的DNA 疫苗研究现状
1.3 禽痘病毒载体研究进展
1.3.1 禽痘病毒的生物学及分子生物学特征
1.3.2 禽痘病毒作为载体的特性
1.3.3 禽痘病毒载体的构建
1.3.4 APMV 病的禽痘病毒活载体疫苗研究现状
1.3.5 小结
1.4 本研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒与细胞
2.1.2 质粒与菌种
2.1.3 引物
2.1.4 酶及主要试剂
2.1.5 SPF 鸡胚
2.1.6 细胞培养所用试剂
2.1.7 实验动物
2.1.8 主要实验仪器与设备
2.2 实验方法
2.2.1 GPMV 的增殖与初步纯化
2.2.2 GPMV 总RNA 的提取
2.2.3 反转录合成cDNA
2.2.4 F, HN 和NP 基因的克隆与序列分析
2.2.5 重组原核表达质粒pGEX-6P-NP 的构建
2.2.6 表达GPMV 的F、HN 基因及双基因重组禽痘病毒的构建
2.2.7 F, HN 和NP 基因的DNA 疫苗质粒的构建
2.2.8 pGEX-NP 的原核表达
2.2.9 重组蛋白的活性检测
2.2.10 间接ELISA 试验条件的优化
2.2.11 重组真核表达质粒在293T 细胞中的瞬时表达
2.2.12 DNA 疫苗的免疫保护效果
3 实验结果
3.1 GPMV F、HN 和NP 基因的克隆与序列分析
3.1.1 GPMV F、HN 和NP 基因的RT-PCR 扩增结果
3.1.2 重组质粒pMD18-T-F、HN 和NP 的酶切鉴定
3.1.3 F、HN 和NP 基因的序列测定与分析
3.2 GPMV 多表达载体的构建
3.2.1 重组质粒pGEX-6P-NP 的鉴定
3.2.2 表达GPMV 的F、HN 及双基因重组禽痘病毒转移载体的鉴定
3.2.3 DNA 疫苗质粒的酶切鉴定
3.3 NP 基因的原核表达及重组蛋白ELISA 试验条件的优化
3.3.1 重组原核表达NP 蛋白的SDS-PAGE 分析
3.3.2 重组原核表达蛋白的Western-blot 分析
3.3.3 重组表达蛋白纯化产物Dot-ELISA
3.3.4 优化的间接ELISA 试验条件
3.4 DNA 疫苗在293T 细胞中的瞬时表达
3.5 DNA 疫苗的免疫效果
3.5.1 抗体的检测
3.5.2 T 细胞亚类检测
3.5.3 不同疫苗免疫对GPMV 攻击的免疫保护性
4 讨论
4.1 本实验所应用的鹅副粘病毒株
4.2 鹅副粘病毒JS/1/97/GO 株主要保护性抗原基因
4.2.1 融合蛋白(F)基因
4.2.2 血凝素-神经氨酸酶(HN)基因
4.2.3 核衣壳蛋白(NP)基因
4.3 多表达载体质粒的构建
4.4 原核表达的重组抗原
4.5 ELISA 诊断方法的研究
4.6 DNA 疫苗的研究
4.7 本试验的创新
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的学术论文
发布时间: 2005-10-31
参考文献
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