一种新型的NADH荧光探针

论文摘要

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及其还原型（NADH）是生物体中广泛存在的辅酶。由于NADH在代谢和信号转导中的中心作用及其在疾病诊疗中的重要性,对组织与细胞内NADH的分布及动态变化进行生物成像将为相关研究提供重要的信息。但长期以来应用的NADH自发荧光成像的方法由于无法区分NADH与NADPH这两种不同的功能分子而存在重大缺陷,严重制约了相关研究的发展。本论文基于分子结构理性设计与蛋白质工程方法,利用对NADH特异性响应的ydiH蛋白与黄色荧光蛋白融合,构建了在NADH结合后荧光性质发生改变的荧光蛋白探针Perex。通过理性设计与定点突变的方法对Perex探针进行了改造与筛选,以提高Perex探针的对NADH的响应并降低其核苷酸的非特异性结合,最终得到了两个在不同浓度范围内灵敏、特异性响应NADH的Perex探针。本论文详细研究了物理及化学环境,pH、温度、以及其它吡啶核苷酸盐及类似物,对Perex系列探针的荧光性质,对探针的影响.。细胞生物学实验显示,该系列探针能在活细胞内表达并定位于亚细胞结构,指示生理浓度的NADH变化。本论文研究所得到的Perex探针将可用于建立监测NADH在活体、组织、细胞甚至亚细胞结构中分布的高时空分辨成像技术,可为对细胞生物学、生理学等生命科学基础研究及生物工程、代谢工程等应用基础领域提供有力研究工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD（H）性质及作用
• 1.1.1 NAD（H）的理化性质
• +/NADH的含量和状态'>1.1.2 细胞中NAD⁺/NADH的含量和状态
• 1.1.3 NAD（H）的生物合成途径
• 1.1.4 NAD（H）的生理作用
• 1.2 常用的NAD（H）分子检测方法
• 1.2.1 紫外分光光度法
• 1.2.2 电泳法
• 1.2.3 色谱法
• 1.2.4 酶法分析
• 1.2.5 质谱法
• 1.2.6 电化学法
• 1.2.7 荧光成像
• 1.2.8 构建新型NADH探针意义
• 1.3 荧光蛋白的性质及应用
• 1.3.1 荧光蛋白的研究进展
• 1.3.2 绿色荧光蛋白的结构
• 1.3.3 荧光蛋白的应用
• 1.4 展望
• 第2章 Perex重组质粒的构建及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 主要实验仪器及设备
• 2.1.4 试剂配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验流程
• 2.2.2 Bacillus subtilis 168基因组提取
• 2.2.3 目的基因亚克隆
• 2.2.4 重组质粒的构建
• 2.2.5 重组质粒的鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 目的基因ydiH及荧光蛋白基因YFP的扩增结果
• 2.3.2 PCR产物回收与纯化
• 2.3.3 SOE PCR扩增结果
• 2.3.4 SOE PCR产物回收与纯化
• 2.3.5 目的片段亚克隆结果
• 2.3.6 完整的原核表达质粒构建结果
• 2.3.7 构建探针系列
• 2.4 分析与讨论
• 2.4.1 实验原理
• 2.4.2 重组质粒构建方案选择
• 2.4.3 构建方案的优化
• 2.4.4 筛选方案的选择
• 第3章 Perex蛋白的表达、纯化及性质的初步研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要实验仪器及设备
• 3.1.4 试剂配置
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验流程
• 3.2.2 不同表达条件评估
• 3.2.3 目的基因的表达
• 3.2.4 表达产物的获取
• 3.2.5 表达产物的纯化
• 3.2.6 表达产物的鉴定
• 3.2.7 表达产物的性质测定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 表达条件评估
• 3.3.2 表达产物获取
• 3.3.3 纯化方法建立
• 3.3.4 蛋白表达、纯化
• 3.3.5 探针光谱性质测定
• 3.3.6 探针结合性质测定
• 3.4 分析与讨论
• 3.4.1 实验原理
• 4.4.2 表达菌株的选择
• 3.4.3 不同表达条件的确定
• 3.4.4 蛋白纯化方法的建立
• 3.4.5 利用工具软件预测分析蛋白相关性质
• 3.4.6 探针性质的分析
• 第4章 Perex蛋白的突变体构建及鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株及质粒
• 4.1.2 酶和试剂
• 4.1.3 主要实验仪器及设备
• 4.1.4 试剂配置
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验流程
• 4.2.2 突变文库建立
• 4.2.3 突变系列质粒双酶切
• 4.2.4 突变体质粒鉴定
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 定点突变PCR扩增结果
• 4.3.2 双酶切结果
• 4.3.3 转化结果
• 4.3.4 突变体质粒鉴定结果
• 4.4 分析与讨论
• 4.4.1 实验原理
• 4.4.2 突变构建
• 4.4.3 筛选鉴定方法选择
• 第5章 Perex蛋白突变体的高通量筛选及性质的初步研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 主要实验仪器及设备
• 5.1.4 试剂配置
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 实验流程
• 5.2.2 目的基因的表达
• 5.2.3 表达产物的获取
• 5.2.4 表达产物的纯化
• 5.2.5 表达产物的鉴定
• 5.2.6 表达产物的性质测定
• 5.2.7 表达产物的高通量筛选
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 高通量蛋白纯化结果
• 5.3.2 高通量筛选结果
• 5.3.3 不同的核苷酸对探针影响
• 5.3.4 不同pH下结合曲线
• 5.3.5 结合-响应时间曲线
• 5.4 分析与讨论
• 5.4.1 实验原理
• 5.4.2 高通量筛选结果
• 5.4.3 不同的核苷酸对探针影响
• 5.4.4 pH对探针结合性质影响
• 5.4.5 探针的结合-响应时间
• 5.4.6 最优化探针
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢