tau蛋白磷酸化在锰诱导的神经毒性中的作用

论文摘要

【背景】锰是一种机体必需的微量元素,但过多的锰进入体内则会产生毒性作用。锰的毒性作用主要表现为神经系统功能异常,慢性锰中毒主要表现为锥体外系神经功能障碍,类似于帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的症状。tau蛋白是微管相关蛋白家族的成员之一,在神经系统的发育和维持微管功能等方面具有重要作用,多种神经系统退行性疾病中都出现了与tau蛋白相关的特征性病理改变。tau蛋白过度磷酸化可影响其正常功能,引起一系列的病理损害。tau蛋白过度磷酸化后,其促微管聚合功能丧失,神经元微管解体,易于聚集成双螺旋丝（paired helical filaments,PHF）以及形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle,NFT）结构,并转变成为毒性分子,可结合神经元中正常的微管相关蛋白,使微管结构崩解,神经元退变。多种蛋白激酶系统参与了tau蛋白的磷酸化过程,其中PI3K/Akt/GSK-3β以及MAPK信号通路是近年来研究tau蛋白磷酸化过程中涉及较多的两个信号通路。此外,氧化应激也被认为与神经元内tau蛋白的磷酸化过程密切相关,而我们此前的研究证实,锰可以通过诱导氧化应激水平的增高从而发挥其神经毒性效应。【目的】从细胞水平研究锰对神经元tau蛋白磷酸化水平的影响及其在锰诱导的神经毒性中的作用,并且从信号转导和氧化应激的角度探讨这个过程中的分子机制,从而为进一步阐明锰神经毒性的机制以及提出有效的锰神经毒性防护措施提供新的思路和理论依据。【方法】（1）利用培养的高分化型PC12细胞建立锰诱导多巴胺能神经元损伤的细胞模型。（2）MTT、LDH活性检测、流式细胞术、电镜等检测细胞毒性。（3）免疫荧光染色检测细胞骨架形态的变化。（4）Western Blot技术检测tau蛋白磷酸化水平以及相关信号通路的变化。（5）ROS水平检测了解细胞内氧化应激的水平。【结果】1.锰对PC12细胞损伤的诱导作用MTT结果显示,随着锰作用浓度的增高,PC12细胞活力逐渐下降。LDH活性检测结果显示,随着锰作用浓度的增高,PC12的损伤逐渐加重。流式细胞仪分析结果显示,锰可诱导PC12细胞凋亡率的显著增高。电镜检测可发现,锰染毒后PC12细胞可出现典型的凋亡超微结构特征。2.锰可诱导PC12细胞骨架的改变锰在诱导PC12细胞损伤的同时,也使细胞骨架形态出现了显著改变。免疫荧光染色结果显示,对照组细胞骨架形态清晰,排列规则、有序,细胞突起细长。锰作用后,PC12细胞骨架形态模糊、崩解,失去原有的规则排列方式。细胞胞体变大,突起缩短、或者消失。同时,细胞核出现固缩、碎裂等变化。此外,锰诱导细胞骨架改变的程度与其作用浓度呈正相关。3.锰诱导PC12细胞tau蛋白磷酸化水平的增高在不同浓度锰（0、100、300、500μmol/L）作用相同时间（6h）后以及300μmol/L锰作用不同时间（0、0.5、1、3、6h）后,PC12细胞的tau蛋白在Ser199、Ser202、Ser396和Ser404等位点均出现了磷酸化水平的增高。4.锰诱导PC12细胞tau蛋白磷酸化的信号转导机制研究结果显示,锰可诱导ERK MAPK、PI3K/Akt以及GSK-3β的激活,抑制这些信号通路的激活均能够抑制锰所诱导的tau蛋白磷酸化、细胞骨架的改变以及细胞损伤,而抑制ERK MAPK的激活还可抑制GSK-3β活性的增高,表明在这个过程中ERK MAPK可能在GSK-3β的上游。5.氧化应激在锰诱导的tau蛋白过度磷酸化过程中的作用锰可以诱导PC12细胞氧化应激水平的增高,表现为ROS水平的增高。而抗氧化剂NAC可抑制锰所诱导的PC12细胞凋亡和tau蛋白的过度磷酸化。同时,细胞骨架的形态也有所改善。【结论】1.在诱导PC12细胞增殖抑制以及损伤、凋亡的同时,锰可以诱导微管相关蛋白tau磷酸化水平的增高。tau的过度磷酸化可进一步诱导细胞骨架结构和功能的异常并进一步诱导PC12细胞的损伤。2.锰所诱导的tau蛋白磷酸化过程受到蛋白激酶的调控,其中锰可通过激活ERK MAPK进一步激活GSK-3β信号通路从而诱导tau蛋白的磷酸化,同时锰还可能通过诱导PI3K/Akt信号通路的激活诱导tau蛋白的过度磷酸化和相应的细胞毒性。3.锰可以通过诱导氧化应激水平的增高并进一步诱导tau蛋白的过度磷酸化。通过补充抗氧化剂有望成为抑制锰毒性的一个有效途径。综上所述,我们的研究初步阐明了锰对多巴胺能神经元tau蛋白磷酸化水平的影响并初步探讨了相关的分子机制,结果将为进一步阐明锰神经毒性的分子机制以及探寻有效的防护措施提供新的思路和理论依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 锰中毒体外模型的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 锰对PC12 细胞骨架的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 锰对PC12 细胞tau 蛋白磷酸化水平的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验四 锰诱导PC12 细胞tau 蛋白过度磷酸化的信号转导机制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验五 氧化应激在锰诱导的tau 蛋白过度磷酸化过程中的作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢