盐酸法舒地尔对脂多糖致大鼠大脑皮层神经元损伤的保护作用及机制研究

论文摘要

目的和背景细胞凋亡与神经系统疾病有着十分重要的联系。在一些神经系统变性疾病中如阿尔茨海默病（Alzheimer Dementia, AD）、帕金森病（Parkinson,s disease, PD）、进行性脊肌萎缩症（SMA）、亨廷登病（HD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）；朊病毒感染；缺血/缺氧性神经元损害；其它中枢神经系统疾病中如多形性胶质母细胞瘤、脑外伤、HIV性脑炎、实验条件下海人酸诱导的癫痫、在啮齿类动物模型及人的癫痫持续状态,都可发现或诱导出细胞凋亡。抑制细胞调亡即可抑制和/或延缓神经系统疾病,这对神经系统变性疾病、脑血管病等的治疗提供了新的理论基础。在细胞凋亡的发病过程中细胞信号转导途径是重要的一个环节或一个方面,c-Jun N端蛋白质激酶（c-Jun-N-protein kinase, JNK）信号通路是细胞信号转导途径中重要的通路之一。细胞的凋亡作用与JNK通路的激活有关。探讨JNK通路在中枢神经系统疾病的发生、发展过程中的变化规律及多种疾病发生发展的分子机制,以便于我们采取更合理的信号传导阻断剂或激活剂,为我们治疗神经系统疾病提供了另一种手段。盐酸法舒地尔（fasudil hydro chloride, FSD）是一种新型、多靶点的Rho激酶抑制剂,细胞内Ca2+拮抗剂；其对急性缺血性脑损害具有显著的神经保护和治疗作用,在脑血管疾病中的临床作用逐渐受到重视。临床上主要用于治疗脑梗塞、蛛网膜下腔出血后引起的迟发性脑血管病（DINDS）、短暂性脑缺血发作（TIA）、椎基底动脉供血不足、脑出血恢复期、脑外科手术后及介入治疗后引起的脑血管痉挛等,近来研究表明盐酸法舒地尔亦具有抑制细胞凋亡作用,但具体机制尚缺乏深入的研究。本实验以体外培养的大鼠大脑皮层神经元为研究对象,脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导神经元细胞建立损伤模型,盐酸法舒地尔作为干预因素,检测神经元凋亡率及JNK1在细胞内表达变化,进一步探讨JNK1在细胞凋亡中的作用及盐酸法舒地尔在抑制细胞凋亡过程中可能的机制,希望对神经系统损伤疾病的防治提供一些理论依据,为临床上治疗神经系统疾病提供实验依据。材料与方法1.健康新生（出生24h以内）Wistar大鼠大脑皮层神经细胞的原代培养。2.利用10mg/LLPS作用于培养7d的大鼠大脑皮层神经元,制备神经细胞损伤模型。同时加入不同浓度盐酸法舒地尔,观察盐酸法舒地尔对LPS导致的神经细胞损伤的保护作用。3.实验分组：对照组、LPS组、盐酸法舒地尔1组（终浓度50μmol/L）、盐酸法舒地尔2组（终浓度100μmol/L）、盐酸法舒地尔3组（终浓度200μmol/L）。4.采用倒置显微镜镜下观察神经细胞形态变化；吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）荧光染色以及Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡情况；测定培养液中乳酸脱氢酶（LDH）浓度检测胞膜稳定性；免疫荧光染色检测磷酸化JNK1表达变化。5.用SPSS13.0统计软件进行分析。所有数据均以均数±标准差（x±s）表示,经方差齐性检验后,多组均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）,组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法）。P<0.05为统计学有差异,P<0.01为统计学有显著差异。结果1.倒置相差显微镜下观察,神经细胞暴露在10 mg/L LPS,在换回原培养液后相同时间点,LPS组受损细胞较对照组显著增多,盐酸法舒地尔干预组受损细胞虽较对照组有所增多,但明显少于LPS组。2. AO/EB荧光染色、Hoechst 33258荧光染色显示,神经细胞暴露在10mg/L LPS,在换回原培养液后相同时间点,LPS组细胞凋亡率较对照组显著升高（P均<0.05）,盐酸法舒地尔组细胞凋亡率虽较对照组有所升高,但明显低于LPS组（P均<0.05）。3.LDH活性测定检测现示,神经细胞暴露在10mg/LLPS,在换回原培养液后相同时间点,LPS组细胞培养液中LDH活性较对照组显著升高（P均<0.05）,盐酸法舒地尔干预组LDH活性虽较对照组有所升高,但明显低于LPS组（P均<0.05）。4.免疫荧光染色检测磷酸化JNK1结果显示,神经细胞暴露在10mg/LLPS,在换回原培养液后相同时间点,LPS组细胞荧光强度较对照组显著增强（P均<0.05）,盐酸法舒地尔组细胞荧光强度虽较对照组有所增强,但明显弱于LPS组（P均<0.05）。结论1.LPS能够成功诱导体外培养的大鼠大脑皮层神经元损伤。2.在LPS诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡过程中磷酸化JNK1表达上调。3.盐酸法舒地尔能够改善损伤神经元的形态,稳定细胞膜,减少LPS诱导的细胞凋亡,其可能机制为通过抑制磷酸化JNK1表达上调而抑制细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩略词
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述 JNK及支架蛋白在细胞凋亡中的研究进展
• 参考文献
• 个人简历
• 在学期间发表的学术论文
• 致谢