论文摘要
1.短尾蝮蛇毒解离素的分离纯化及理化性质测定应用Superdex 75和Sephadex G-25凝胶过滤色谱、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱和Lichrospher C18反相色谱从短尾蝮蛇毒中纯化得一个解离素纯品,暂定名为GbvⅣ4。GbvⅣ4在SDS-PAGE（Tris-Tricine系统）凝胶电泳中,呈单一蛋白条带,质谱法测定其相对分子质量为7442Da,采用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳测定其等电点约为6.3。自动电位滴定法测定磷脂酶A2活力和Rick方法测定蛋白酶活力,结果均为0。氨基酸序列测定发现它由70个氨基酸组成,含有RGD三肽活性中心,6对二硫键,符合中链解离素特征。通过Genbank检索,未发现与GbvⅣ4序列完全一致的氨基酸序列,是一种新的解离素蛋白。2. GbvⅣ4对血小板聚集的影响采用经典的Born法,发现GbvⅣ4在体外可抑制多种聚集剂诱导的血小板聚集,且该作用呈明显的量效关系,GbvⅣ4对ADP、凝血酶诱导的血小板聚集的EC50分别为0.298μg/ml和0.577μg/ml。3. GbvⅣ4对人脐静脉内皮细胞株ECV304生长的影响以SRB法观察GbvⅣ4对人脐静脉内皮细胞株ECV304生长的抑制作用,测定其IC50,结果GbvⅣ4使细胞突起回缩,细胞变圆,细胞浮起不再贴壁且聚集成簇,失去正常的铺路石状。GbvⅣ4呈剂量依赖性的抑制ECV304的生长,其作用24h的IC50为25.42μg/ml。4. GbvⅣ4对鸡胚尿囊膜（Chick Chorioallantoic membrane,CAM）新生血管生成的影响选用鸡胚尿囊膜模型观察GbvⅣ4对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用,采用测量区血管面积与测量区面积的比值（VA/CAM）评价抑制程度。结果显示的GbvⅣ4 3.098和11.79μg处理后可见鸡胚CAM血管生成减少,分布稀疏,分支减少,但形态基本正常,呈树状分布,与NS组相比VA/CAM显著减少（P﹤0.01）。5. GbvⅣ4对黑色素瘤B16细胞体外粘附能力的影响细胞-基质粘附实验观察GbvⅣ4对B16细胞粘附能力的影响。GbvⅣ4使细胞在给药后4h细胞突起回缩变圆,且聚集成团簇状。采用MTT法,发现GbvⅣ4可抑制肿瘤细胞与纤维连接蛋白的粘附作用,抑制作用呈浓度依赖性,在终浓度16μg/ml时抑制率为59.34%。6. GbvⅣ4对黑色素瘤B16细胞体外迁移能力的影响采用划痕实验检测B16细胞体外迁移能力。在划痕后48h,对照组的细胞在划痕处已经基本长满,而GbvⅣ4组的无细胞区仍较明显。7. GbvⅣ4对黑色素瘤B16和B16–F10细胞体外侵袭的影响应用Transwell小室重建基底膜侵袭实验观察GbvⅣ4对B16和B16–F10细胞侵袭能力的影响,药物与细胞作用48h后,发现GbvⅣ4对B16和B16–F10细胞穿越基底膜的能力显著降低,穿过基底膜的细胞数量与GbvⅣ4的浓度成反比.8. GbvⅣ4对黑色素瘤B16–F10小鼠实验性肺转移模型的影响采用裸BALB/c小鼠黑色素瘤B16–F10实验转移模型观察解离素对肿瘤转移的影响,解离素腹腔注射明显减少接种黑色素瘤B16–F10细胞小鼠的肺重和肺转移灶数量,解离素（50、100μg/kg×14 d）和环磷酰胺（50 mg/kg×2 d）对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制率分别为67.8%、82.8%和48.1%。结论:从江浙短尾蝮蛇毒中分离得到一个解离素纯品GbvⅣ4,由70个氨基酸组成,含有RGD三肽活性中心,分子量为7442Da,等电点6.3。GbvⅣ4能剂量依赖地抑制ADP及凝血酶诱导的血小板聚集;对人脐静脉内皮细胞株ECV304的生长有明显的抑制作用;GbvⅣ4具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用;GbvⅣ4在体外能明显降低肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭能力。对小鼠B16黑色素瘤的实验性转移肺癌有显著的抑制作用。
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