论文摘要
研究背景和目的食管癌是全球威胁人类生命和健康的最常见恶性肿瘤之一，我国每年食管癌发病人数占全球发病总人数的一半以上，以食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）最为常见。放射治疗作为食管癌的主要治疗手段之一，但食管癌常规放疗疗效较差，5年生存率不超过10%。局部复发转移是中晚期食管癌放射治疗失败的主要原因，而关于放疗后食管癌局部复发和转移的机制尚不清楚。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮细胞失去上皮细胞特征和极性同时获得间质样表型及侵袭潜能的现象。EMT不仅在肿瘤侵袭和转移中发挥着关键性的作用，而且EMT与肿瘤细胞耐药、肿瘤干细胞形成密切相关。研究表明电离辐射（Ionizing Radiation, IR）诱导肿瘤细胞发生EMT，增加肿瘤细胞转移能力。关于IR诱导肿瘤细胞发生EMT的机制，目前尚不完全清楚。关于IR诱导肿瘤细胞发生EMT是否与肿瘤获得性放疗抵抗有关，国内外尚无文献报道。本课题深入研究IR诱导食管鳞癌细胞发生EMT增加转移潜能和放疗抗性的作用及机制，寻找关键作用靶点，以期通过逆转EMT来减少放疗后局部复发和转移风险，为提高放疗疗效提供实验基础和理论依据。方法1.观察IR后食管鳞癌Eca109、Te1细胞和放疗抵抗细胞Eca109R的形态；采用免疫荧光检测IR后Eca109和Te1细胞EMT标志蛋白的表达；采用Real Time PCR、Western blot检测IR后Eca109、Te1细胞和Eca109R EMT标志物mRNA和蛋白的表达；采用免疫组化法检测IR后Eca109裸鼠移植瘤EMT标志蛋白的表达；采用划痕实验和Transwell移动侵袭实验检测IR后Eca109和Te1细胞侵袭迁移能力；采用平板克隆形成实验检测5Gy X-ray照射后的Eca109细胞和Eca109R细胞放疗敏感性。2.采用ELISA法检测IR后食管鳞癌Eca109、Te1细胞分泌的IL-6的含量；采用Real Time PCR和Western blot检测IR后Eca109和Te1细胞IL-6/Stat3/Twist通路mRNA和蛋白的表达；采用Real Time PCR和Western blot检测放疗抵抗细胞Eca109R EMT关键转录因子TwistmRNA和蛋白的表达。3.收集30例新辅助放疗食管鳞癌病人放疗前后手术标本，采用免疫组化法检测放疗前后肿瘤组织中EMT标志蛋白和IL-6/Stat3/Twist通路蛋白的表达，分析放疗前后表达的差异。4.使用Jak2特异性阻断剂AG490和sh-Twist阻断IL-6/Stat3/Twist通路；采用Western blot检测IR联合AG490和sh-Twist后Eca109和Te1细胞EMT标志蛋白和Stat3/p-Stat3/Twist通路蛋白的表达；采用免疫组化法检测IR联合AG490和sh-Twist后食管鳞癌Eca109裸鼠移植瘤EMT标志蛋白的表达；采用划痕实验和Transwell移动侵袭实验检测IR联合AG490和sh-Twist后Eca109和Te1细胞侵袭迁移能力。5.采用RNA干扰技术沉默食管鳞癌放疗抵抗株Eca109R中EMT关键转录因子Twist的表达；采用Real Time PCR和Western blot检测Eca109R EMT标志和关键转录因子Twist mRNA和蛋白的表达；采用平板克隆形成实验检测Eca109R细胞放疗敏感性。6.采用MTT检测sh-Twist联合IR后Eca109R细胞的存活率；采用流式细胞仪检测细胞凋亡；建立Eca109R细胞裸鼠移植瘤模型，观察移植瘤生长；TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡。采用Western blot检测Eca109R细胞Akt通路及相关凋亡蛋白的表达。结果1. IR后的食管癌鳞癌Eca109、Te1细胞和放疗抵抗细胞Eca109R形态由圆形椭圆形变为梭形纺锤形；与未放疗组比较，IR后的Eca109、Te1细胞和Eca109R上皮标志蛋白E-cadherin的表达显著减少，间质标志蛋白N-cadherin和Vimentin的表达显著增多；与未放疗组比较，10Gy放疗后Eca109裸鼠移植瘤E-cadherin的表达减低，N-cadherin和Vimentin的表达显著增高；与未放疗组比较，IR后的Eca109、Te1细胞侵袭迁移能力增加；与未放疗组比较，5Gy X-ray照射后的Eca109细胞和Eca109R细胞放疗抗性显著增加。2.与未放疗组比较，IR后食管鳞癌Eca109、Te1细胞分泌的IL-6显著增加；与未放疗组比较，IR后食管鳞癌Eca109、Te1细胞IL-6/Stat3/Twist通路mRNA和蛋白的表达上调；与未放疗组比较，放疗抵抗细胞Eca109R EMT关键转录因子Twist mRNA和蛋白的表达升高。3.新辅助放疗食管鳞癌病人放疗前后肿瘤组织中EMT标志蛋白和IL-6/Stat3/Twist通路蛋白的表达有显著差异。与放疗前比较，新辅助放疗后食管鳞癌组织中高表达E-cadherin的病例数比例减小，高表达N-cadherin和Vimentin的病例数比例增大，高表达IL-6/Stat3/Twist通路蛋白的病例数比例增大。4.与单纯放疗组比较，联合AG490和sh-twist组食管鳞癌Eca109、Te1细胞上皮标志蛋白E-cadherin的表达显著增高，间质标志蛋白N-cadherin和Vimentin表达显著降低，p-Stat3和Twist蛋白表达显著降低；与单纯放疗组比较，联合AG490和sh-twist组食管鳞癌Eca109裸鼠移植瘤E-cadherin表达显著增高，N-cadherin和Vimentin表达显著降低；与单纯放疗组比较，联合AG490和sh-twist组食管鳞癌Eca109、Te1细胞侵袭迁移能力降低。5.与Eca109R/sh-NC组比较，Eca109R/sh-twist组细胞上皮标志蛋白E-cadherin表达显著增高，间质标志蛋白N-cadherin和Vimentin表达显著降低；与Eca109R/sh-NC组比较，Eca109R/sh-twist组放疗后细胞克隆形成率降低，放疗敏感性增加。6.与Eca109R/sh-NC组比较，Eca109R/sh-twist组放疗后细胞存活率降低，细胞凋亡率增加，移植瘤生长减慢，移植瘤组织凋亡细胞增多；与Eca109R/sh-NC组比较，Eca109R/sh-twist组细胞p-Akt和抗凋亡蛋白表达下调，凋亡蛋白表达上调。结论1. IR诱导食管鳞癌细胞发生EMT增加转移潜能和放疗抗性。2. IR激活IL-6/Stat3/Twist通路促进食管癌细胞发生EMT。3.新辅助放疗激活食管鳞癌组织IL-6/Stat3/Twist通路促进EMT。4.阻断IL-6/Stat3/Twist通路逆转IR诱导的食管鳞癌细胞EMT和转移潜能获得。5.沉默Twist表达逆转食管鳞癌放疗抵抗细胞EMT，逆转放疗抵抗细胞放疗抗性。6.沉默Twist表达抑制Akt活化介导的抑增殖促凋亡作用，增加食管鳞癌放疗抵抗细胞放疗敏感性。