产脂肪酶细菌的筛选以及酶基因的克隆表达

论文摘要

本文主要从脂肪酶产生菌的筛选、酶活性的研究、产酶菌株对小鼠的部分微生态学效应及脂肪酶基因的克隆表达四个方面进行了研究。1.从富含油污泥土中经过富集、平板初筛选及摇瓶复筛,筛选得到了具有脂肪酶活的8株菌,其中PZ04酶活最高。通过传统的鉴定手段和现代分子生物学技术相结合的方法,确定了PZ04属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对PZ04所产脂肪酶酶学性质研究表明：PZ04脂肪酶粗酶液最适温度为37℃,最适pH为8.7,在pH8.0-10.0温度20-45℃的范围内,酶活性保持在65%以上。10mM/L的Zn2+、Mg2+、Ca2+能够提高脂肪酶的活力而Cu2+和Fe2+有抑制性,使脂肪酶活力下降。2.选用三周龄小鼠96只,随机分为3组,分别饲喂基础日粮中用添加0.1%的PZ04制成浓度为5×108CFU/g和1×109CFU/g的芽孢杆菌制剂,和饲喂基础日粮的空白对照组。实验结果表明芽孢杆菌制剂均能改善小鼠生长性能而1×109CFU/g浓度芽孢杆菌制剂在4-5周龄时显著提高小鼠周增重量；在3—4周龄阶段使用芽孢杆菌制剂组的免疫器官指数与其空白组相比差异显著（P<0.05）；采用PCR-DGGE方法分析小鼠不同周龄肠道微生物菌群变化趋势,PCR-DGGE指纹图谱显示,饲喂1×109CFU/g浓度芽孢杆菌制剂1周后,具有调节仔鼠断奶后的肠道菌群结构,在饲喂4周后使肠道中菌群数量增多。芽孢杆菌制剂起到了改善小鼠生长性能和提高免疫力,调节肠道菌群的作用。3.对扩增的PZ04脂肪酶基因进行克隆,通过对HidⅢ、XhoⅠ双酶切、连接,将PZ04脂肪酶基因定向插入pET-28a（+）,经HidⅢ、XhoⅠ双酶切鉴定表明,成功构建重组表达质粒pET-28a-PZ04,并转入表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,表达产物大小为26KD左右。对表达条件进行优化,确定最佳表达条件为IPTG 0.2mmol/L,37℃诱导4h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法对其进行纯化,蛋白纯化倍数达到10.2倍。对重组脂肪酶酶学性质研究,其脂肪酶在pH8.0-pH9.5之间相对酶活性提高到75%以上,在温度达到60℃时仍有50%以上的相对活性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 1 微生物脂肪酶的研究进展
• 1.1 产脂肪酶微生物种类
• 1.2 微生物脂肪酶基因研究
• 2 脂肪酶的应用
• 2.1 脂肪酶在食品加工中的应用
• 2.2 脂肪酶在医药中的应用
• 2.3 脂肪酶在化工业中的应用
• 2.4 脂肪酶在环境治理中的应用
• 2.5 脂肪酶在生物柴油中的应用
• 2.6 脂肪酶作为饲料添加剂的应用
• 3 微生物脂肪酶的制备
• 3.1 脂肪酶的分离提取
• 3.2 全细胞生物作为催化剂
• 3.3 提高微生物脂肪酶产量和活性的方法
• 4 研究目的和意义
• 试验一 产脂肪酶细菌的筛选及对小鼠部分微生态学效应研究
• 1 实验材料
• 1.1 土样
• 1.2 主要试剂及制备方法
• 1.3 培养基的配制
• 1.4 主要仪器
• 1.5 实验动物
• 2 试验方法
• 2.1 产脂肪酶菌株的筛选
• 2.2 产脂肪酶菌株的鉴定
• 2.3 菌株所产脂肪酶性质
• 2.4 菌株生长曲线测定
• 2.5 产脂肪酶细菌对小鼠的部分微生态学效应
• 3 结果与分析
• 3.1 产脂肪酶菌初步筛选结果
• 3.2 产脂肪酶菌株的鉴定
• 3.3 菌株所产脂肪酶性质
• 3.4 菌株生长曲线
• 3.5 菌株的安全性试验
• 3.6 芽孢杆菌PZ04制剂对小鼠增重的影响
• 3.7 芽孢杆菌PZ04制剂对小鼠免疫器官的影响
• 3.8 小鼠肠道菌群变化的PCR-DGGE分析
• 3.9 小鼠不同周龄肠道菌群聚类分析
• 4 讨论
• 4.1 产脂肪酶细菌的鉴定
• 4.2 脂肪酶酶学性质
• 4.3 菌株的安全性
• 4.4 饲喂不同浓度的芽孢杆菌制剂对小鼠增重的影响
• 4.5 饲喂不同浓度的芽孢杆菌制剂对小鼠免疫器官的影响
• 4.6 饲喂不同浓度的芽孢杆菌制剂对小鼠肠道菌群的影响
• 试验二 枯草芽孢杆菌PZ04脂肪酶基因的克隆表达
• 1 实验材料
• 1.1 实验菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液配制
• 2 试验方法
• 2.1 PCR扩增PZ04脂肪酶基因
• 2.2 载体pET-28a（+）的限制性酶切、纯化及去磷酸化处理
• 2.3 目的基因与载体的连接
• 2.4 感受态细胞的制备
• 2.5 重组表达菌株的构建
• 2.6 脂肪酶基因在BL21（DE3）菌株中的诱导表达
• 2.7 诱导条件的优化
• 2.8 脂肪酶蛋白的纯化
• 3 结果与分析
• 3.1 PZO4脂肪酶基因的PCR扩增
• 3.2 双酶切检测空白质粒pET-28a（+）
• 3.3 重组表达质粒pET-28a-PZ04的鉴定
• 3.5 重组表达菌株的鉴定
• 3.6 重组质粒的诱导表达及表达条件优化
• 3.7 目的蛋白的纯化
• 3.8 纯化后脂肪酶酶活的检测
• 4 讨论
• 4.1 脂肪酶基因的克隆
• 4.2 蛋白表达与纯化
• 4.3 重组菌所产酶的酶学性质
• 结论
• 参考文献
• 致谢