猪早期妊娠诊断胶体金试纸条的研制

论文摘要

孕酮（Progesterone,简称P4）是一种甾体类激素,主要由黄体及胎盘产生。雌性动物性周期中孕酮水平呈规律性变化,发情期孕酮水平最低,黄体期孕酮水平较高,妊娠期孕酮水平则一直维持在较高水平上。传统孕酮检测采用放射免疫方法（RIA）,但鉴于放射性免疫所需设备昂贵,放射物污染环境,不适宜在生产中推广。本研究根据抗原抗体特异性结合原理制备胶体金试纸条,旨在为猪的早期妊娠诊断提供参考,该试纸条不需要专业人员即可使用,便于在市场推广。本研究通过孕酮人工抗原的合成和单克隆抗体的制备,组装了可以用于猪早孕诊断的胶体金试纸条。1孕酮完全抗原的研制为了合成孕酮完全抗原,用O-羧甲基羟胺法将孕酮（P4）肟化,制备半抗原孕酮-3-（O-羧甲基）肟,采用薄层色谱法（TLC）和质谱法鉴定半抗原结构；用混合酸酐法合成孕酮的完全抗原孕酮-牛血清白蛋白（P-BSA）,孕酮-鸡卵清白蛋白（P-OVA）.用紫外扫描和SDS-PAGE电泳对人工抗原进行初步鉴定,再用免疫学的方法对人工抗原进行最终鉴定。TLC试验结果显示孕酮的迁移率为0.4,合成物的迁移率为0.2,初步说明肟化成功,有肟化物产生。质谱图最强m/z386.2为孕酮-3-（O-羧甲基）肟的分子离子峰,与其理论分子量387.52基本一致,证明孕酮的衍生化是成功的。紫外全波长扫描的结果显示BSA的最大吸收峰为278nm,而P-BSA的最大吸收峰偏移到255nm,P-BSA的紫外全波长扫描的波形和BSA相比发生了明显的变化；P-OVA的最大吸收峰为255nm,和OVA最大吸收峰278nm相比发生了偏移,P-OVA的波形和OVA相比发生了明显的变化。初步证明孕酮人工抗原的合成是成功的。结合紫外全波长扫描和考马斯亮蓝法估算P-BSA和P-OVA中半抗原与载体蛋白的偶联比率,测得P-BSA的偶联比率为30：1,P-OVA的偶联比率是4：1。用P-BSA免疫新西兰大白兔4次后得到孕酮多克隆抗体,建立间接ELISA和间接竞争ELISA法检测血清抗体效价和抗体竞争抑制率。结果表明,免疫兔血清的效价达到了1：219,兔血清多克隆抗体竞争抑制率（IC50）为207ng/mL之间。最终证明该完全抗原可以刺激动物产生针对孕酮的高效价、高特异性的抗血清,半抗原孕酮-3-（O-羧甲基）肟和人工抗原P-BSA, P-OVA合成成功。2孕酮单克隆抗体的研制为了制备孕酮的单克隆抗体,用人工合成的孕酮-牛血清白蛋白（P-BSA）作为抗原免疫BALB/C小鼠4次后,取其中一只小鼠的脾细胞,在PEG1450作用下与SP2/0细胞融合,与此同时建立检测孕酮抗体的间接ELISA方法。利用杂交瘤技术和ELISA方法筛选得到1株稳定分泌孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C11。用建立好的间接ELISA方法对其腹水进行效价测定,其效价为1：204800。对这株单抗进行亚型鉴定,结果显示其IgG1的OD450值0.481,Kappa的OD450值0.601,其余的亚型OD450值均小于0.2（OD450≥0.2判为阳性）,说明杂交瘤细胞2C11分泌的抗体亚型为IgG1,轻链类型为Kappa。将这株细胞经体外传代和多次冻存复苏后,连续培养5天,其上清OD450均值分别为1.10、1.12、1.11、1.12、1.19,说明2C11抗体分泌稳定。3检测孕酮的胶体金试纸条的研制利用2C11杂交瘤细胞株的腹水单抗制备检测孕酮的胶体金试纸条。采用免疫竞争法,将2C11分泌的单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上,单克隆抗体包被浓度为18μg/mL。同时将人工合成的P-OVA以0.548mg/mL包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线（T线）,将孕酮单克隆抗体的羊抗鼠二抗以0.625mg/mL包被在硝酸纤维素薄膜表面作为质控线（C线）。T线的人工抗原与待检样品中的孕酮竞争结合胶体金标记的孕酮单克隆抗体,通过T线是否显色判断阴阳性。采用该试纸条检测样品,整个检测过程只需10min,检测限可以达到100ng/mL,与睾酮,雌二醇无交叉反应。说明检测试剂具有较高的灵敏度及特异性,操作便捷,稳定可靠,可作为判断母猪是否怀孕的有效检测手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（Abbreviation）
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 母猪早孕诊断技术研究进展
• 参考文献
• 第二章 小分子抗原人工合成研究进展
• 1 载体的选择
• 2 半抗原修饰物中连接臂的选择
• 3 半抗原修饰物的制备
• 4 半抗原与载体的偶联
• 5 人工抗原的纯化和鉴定
• 5.1 人工抗原的纯化
• 5.2 人工抗原的鉴定
• 6 影响人工抗原合成的因素
• 7 孕酮概述
• 参考文献
• 第三章 胶体金免疫层析技术研究进展
• 1 胶体金免疫技术
• 2 胶体金的制备
• 3 胶体金蛋白偶联物的制备
• 4 胶体金免疫检测技术的两种主要模式
• 4.1 斑点金免疫渗滤法（DIGFA）原理
• 4.2 胶体金免疫层析法（GICA）原理
• 5 胶体金标记免疫分析法的优点
• 6 胶体金免疫检测技术的新进展
• 6.1 进一步提高检测灵敏度
• 6.2 实现检测多元化
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• 第四章 孕酮完全抗原的研制
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 孕酮半抗原和完全抗原的鉴定
• 2.2 SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定孕酮人工抗原
• 2.3 多抗血清效价测定
• 2.4 多抗特异性分析
• 2.5 间接竞争ELISA检测猪尿液中孕酮含量
• 3 分析与讨论
• 4 结论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第五章 孕酮单克隆抗体的研制
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 间接ELISA方法的建立
• 2.2 免疫小鼠血清效价测定结果
• 2.3 融合细胞的筛选结果
• 2.4 腹水制备及腹水效价检测
• 2.5 单克隆抗体的提纯
• 2.6 McAb的亚型鉴定
• 2.7 杂交瘤细胞分泌稳定性检测
• 3 分析与讨论
• 3.1 孕酮单克隆抗体制备的必要性
• 3.2 动物免疫
• 3.3 检测孕酮抗体的间接ELISA方法
• 3.4 血清的选择
• 3.5 腹水效价
• 3.6 单克隆抗体制备
• 4 结论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第六章 检测孕酮的胶体金试纸条的研制
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 孕酮单克隆抗体与胶体金结合的最佳pH确定
• 2.2 孕酮单克隆抗体与胶体金结合的最佳浓度确定（蛋白梯度法）
• 2.3 胶体金-抗体结合物的制备
• 2.4 胶体金-抗体结合物玻璃纤维膜的制备
• 2.5 不同型号硝酸纤维素膜的选择
• 2.6 检测线（T线）条件的优化
• 2.7 质控线（C线）条件的优化
• 2.8 试纸条的组装
• 2.9 结果判定
• 2.10 试纸条的特异性试验
• 2.11 试纸条的敏感性试验
• 3 分析与讨论
• 3.1 蛋白与胶体金结合最佳pH
• 3.2 硝酸纤维素膜的选择和处理
• 3.3 灵敏度
• 4 结论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 全文结论
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录