斑马鱼中囊胚发育相关基因的克隆及功能研究

论文摘要

中囊胚转换（Midblastula transition,MBT）是在爪蟾,果蝇等胚胎发育过程中一个关键的事件。在哺乳类动物中也有类似现象发生。在MBT前的有丝分裂,只有S和M期,其发育过程受母型基因调控,合子型基因几乎没有转录活动。进入MBT之后,才恢复正常的细胞周期控制。cyclin H/cdk7组成的复合物,具有CAK（cdk activating kinase）的功能,又是TFⅡH转录因子的组成之一,TFⅡH通过磷酸化RNA聚合酶（polⅡ）的最大亚基的C末端（CTD）,具有调节RNA聚合酶的功能。在斑马鱼中,cyclin H/cdk7在MBT时扮演什么角色?从未见有研究报道。在本研究中,两个新的编码斑马鱼cyclin H和cdk7的cDNA被克隆,经序列和进化树分析,表明它们分别和人类的cyclin H和cdk7有很高的同源性。RT-PCR和整胚原位杂交实验表明这两个基因均为母源表达。在早期胚胎发育过程中,这两个基因的转录本都是普遍表达,当发育到受精后第五天（days post-fertilization,dpf）时,cyclin H和Cdk7主要在前部神经管,脑,眼睛,生殖器官,肝脏和心脏表达。但Cdk7的表达量低,而且相对更集中。在1-4细胞时过表达Cyclin H或显性失活的Cyclin H,发现过表达cyclin H导致尾部发育畸形;过表达显性失活的Cyclin H影响早期胚胎合子型基因转录的起始,导致胚胎在5 hpf时提前发生凋亡;并导致Cyclin H内源表达较高的组织和器官发育畸形。这些结果表明Cyclin H在斑马鱼早期胚胎发育中是一个必需的基因。曾有报道通过Ethylnitrosourea（ENU）等大规模诱变发现了与MBT发育相关的一些基因。但对MBT发育过程中的其它相关基因还未完全揭示出来。本研究应用美国Affymetrix公司的斑马鱼基因表达谱芯片,对斑马鱼MBT前后的基因表达差异进行了研究。2.5 hpf和4 hpf芯片分析结果显示,有360个基因表达上调,119个基因表达下调。通过Gene Ontology（GO）分析,表明其中某些基因与MBT相关并具有重要作用。我们选择研究的基因要满足两个条件之一:选择表达上调率幅度较大的或选择与细胞分裂,细胞周期调控有关的基因。对选择的基因或EST序列进行PCR验证实验,证实被筛选出的这类基因在MBT前后的表达水平有明显差异。这些基因在MBT中的功能尚需进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 斑马鱼 Cyclin H 和Cdk7 的克隆,表达及 Cyclin H 的功能初探
• 材料和方法
• 结果
• 1 斑马鱼 Cyclin H 和Cdk7 cDNA 的克隆和序列分析
• 2 Cyclin H 和 Cdk7 的 Northern 印迹分析
• 3 RT-PCR 分析Cyclin H 和 Cdk7 在胚胎发育不同时期和不同组织表达模式..
• 4 原位杂交分析Cyclin H 和 Cdk7 基因在胚胎发育过程中空间表达模式
• 5 Cyclin H 过表达对胚胎早期发育的影响
• 6 显性失活的Cyclin H mRNA 对胚胎早期发育的影响
• 7 过表达Cdk7 能补救显性失活的 Cyclin H 对胚胎发育的影响
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 用microarray 分析与中囊胚转换相关的基因
• 材料和方法
• 结果
• 1 2.5 hpf 和4 hpf 杂交探针的制备
• 2 Affymetrix 基因芯片的杂交和数据处理
• 3 4 hpf 和2.5 hpf 发育期基因表达谱的差异分析
• 4 RT-PCR 对部分差异表达基因进行验证
• 讨论
• 参考文献
• 综述 动物中囊胚转换分子机制研究进展
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 致谢