论文摘要
目的;染色体组蛋白N端乙酰化水平由组蛋白乙酰化酶（HAT）和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）动态调控,其可影响组蛋白与DNA的亲和性而改变染色质的状态,从而影响转录因子与DNA序列的结合,对基因表达调控具有类似DNA遗传密码的作用。组蛋白乙酰化是一可逆的动态过程,组蛋白去乙酰化所表现的基因转录沉默,与多种肿瘤的发生与发展有密切的关联。这就为肿瘤治疗提供了一个新的思路——增强HAT表达和/或降低HDACs表达。丙戊酸钠（VPA-Na）广泛应用于抗癫痫临床治疗,一直以其低毒高效著称,近期研究证实其是HDAC的特异性抑制剂之一,本文应用VPA-Na干预乳腺癌细胞系MCF-7,通过观察细胞生长状态、检测细胞增殖活力、细胞凋亡、细胞增殖周期变化以确定其抑制肿瘤细胞生长增殖的作用和量效关系;检测分析Caspase3、Caspase8、Caspase9活性及蛋白表达变化,Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21Waf/cip1蛋白及mRNA表达水平的变化,并探讨了其效应机制。方法;VPA-Na对乳腺癌细胞形态学的影响将乳腺癌细胞以台盼兰染色,加入终浓度0.75mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L的VPA-Na进行干预,同时设不加药仅加等量PBS的对照组,适当条件培养,于药物处理不同时间点取样,倒置显微镜下观察细胞形态。VPA-Na对乳腺癌细胞增殖、凋亡与细胞生长周期的影响（1）细胞增殖检测将终浓度分别为0.75mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L、4.0mmol/L的VPA-Na加入细胞培养体系,另设不加药仅加等量PBS的试验对照组和仅加RPMI1640完全培养液的试剂空白对照,适当条件培养,于药物处理不同时间点取样处理,以MTT比色法测吸收度,计算生长抑制率。（2）细胞凋亡检测将浓度分别为0.75mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L的VPA-Na加入细胞培养体系,另设不加药仅加等量PBS的对照组,适当培养,于药物处理不同时间点取样处理,以流式细胞术法分析。（3）细胞周期分析将浓度分别为0.75mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L的VPA-Na加入细胞培养体系,同时设不加药仅加等量PBS的对照组,适当培养,于药物处理不同时间取样处理,以流式细胞术法分析细胞周期。VPA-Na对乳腺癌细胞作用的分子机制（1）Caspase活性与蛋白表达检测将终浓度1.5mmol/L、3.0mmol/L的VPA-Na加入细胞培养体系,并设不加药仅加等量PBS的对照组,适当培养,以酶标仪测定吸光值,计算Caspase活化值;以FACs分析,计算平均荧光强度指数表示蛋白表达量。（2）Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21Waf/cip1蛋白与mRNA表达分析将终浓度1.5mmol/L、3.0mmol/L的VPA-Na加入细胞培养体系,并设不加药仅加等量PBS的对照组,适当培养,以FACs分析,并计算平均荧光强度指数表示蛋白表达量,以PCR法测定mRNA的量。数据统计分析采用SPSS11.0软件处理系统进行统计学分析,采用ANNOVA检验、PEARSON相关检验。结果;VPA-Na对乳腺癌细胞形态学的影响丙戊酸钠能明显抑制肿瘤细胞生长,药物作用后出现细胞数量减少、细胞大小、形态不均、细胞核固缩、胞浆减少、胞浆内出现空泡,死细胞数目逐渐增多。VPA-Na对乳腺癌细胞增殖、凋亡与细胞生长周期的影响（1）细胞增殖检测0.75～4.0 mmol/L VPA-Na作用24、48、72、96h后,各试验组均出现了不同的生长抑制且呈逐渐升高趋势,差异有显著统计学意义（p<0.001）。（2）细胞凋亡检测0.75～4.0 mmol/L VPA-Na作用24、48、72、96h后,各试验组均出现了不同程度的凋亡增加,最低药物浓度作用24h细胞凋亡率为6.2%,最高药物浓度作用96h凋亡率为28.8%,较对照组凋亡率（4.0%～6.0%）显著升高（p<0.001）。（3）细胞周期分析0.75～4.0 mmol/L VPA-Na作用24、48、72、96h后,对照组的细胞增殖周期G1、S、M期所占比例未见明显改变,而实验组则随药物浓度、作用时间的不同而出现不同程度的细胞增殖周期G1期阻滞,G1期比例由56.4%～78.9%不等,与对照组比较,其升高有显著统计学意义（p<0.001）。VPA-Na对乳腺癌细胞作用的分子机制分子机制研究证实,在VPA-Na干预后Caspase3活性明显升高、蛋白表达被显著上调,其中在3.0mmol/L VPA-Na干预48h后Caspase3活性增加106%,Caspase3蛋白平均荧光强度指数（MFI）为5.34,与对照组比较均显著升高（p<0.001）;Caspase9活性及蛋白表达变化趋势与Caspase3基本相同;而Caspase8活性及蛋白表达在VPA-Na作用后未见明显改变。VPA-Na干预乳腺癌细胞48h后,Cyclin D1蛋白表达被明显下调而P21Waf/cip1蛋白表达被明显上调,与对照组Cyclin D1、P21Waf/cip1蛋白表达比较差异均有显著统计学意义（p<0.001）;Cyclin A、Cyclin E蛋白表达变化未见明显差异（p>0.05）;mRNA水平,与1.5mmol/L、3.0mmol/L丙戊酸钠共同作用48h后,CyclinD1 mRNA表达也被下调而P21Waf/cip1mRNA表达则被明显上调（p<0.001）;Cyclin A mRNA、Cyclin E mRNA表达水平则同样未见明显变化（p>0.05）。结论;上述实验结果证实,丙戊酸钠可明显抑制乳腺癌细胞生长、诱导其凋亡并且造成细胞增殖周期G1期阻滞。在其诱导细胞凋亡过程中,Caspase9介导的细胞色素C凋亡途径被激活,起到了诱导凋亡的关键作用,而Caspase8介导的凋亡受体途径在此过程中并不占主导地位。丙戊酸钠诱导细胞增殖周期G1期阻滞可能通过下列途径分别和/或协同实现;①上调P21Waf/cip1mRNA及P21Waf/cip1蛋白表达,与Cyclins竞争性结合CDKs,广泛的抑制各种Cyclin-CDK复合物,从而使细胞周期停滞在G1期,②下调Cyclin D1 mRNA、Cyclin D1蛋白表达,降低CyclinD1-CDK4/CDK6通路活性,造成细胞增殖不能越过G1期限制点。因此,0.75～4.0mmol/L浓度VPA-Na均有显著抑制乳腺癌细胞生长、诱导凋亡、细胞周期G1期阻滞作用,证实其也可作为乳腺癌治疗药物得到更加广泛的应用。
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标签：组蛋白脱乙酰酶论文; 丙戊酸钠论文; 乳腺癌论文; 生长抑制论文; 细胞凋亡论文; 细胞增殖周期阻滞论文; 机制论文;