重组南瓜胰蛋白酶抑制剂Ⅰ的分离纯化及活性研究

论文摘要

南瓜胰蛋白酶抑制剂I（Cucurbita maxima trypsin inhibitor I,CMTI-I）是一种来源于南瓜籽的经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂,该家族由20多种成员组成。CMTI的成员分子量小、结构简单、作用机制清楚,是研究活性蛋白质分子结构与功能关系及作用机制的良好工具。由于CMTI家族各成员在分子量和结构方面相近,目前很难从南瓜籽中分离纯化出大量单一CMTI,从而限制了其药用开发研究。为此,我室构建了表达重组CMTI-I（rCMTI-I）的GSll5毕赤酵母工程菌。为了对rCMTI-I进行深入的研究与开发,本论文研究制备了以微晶纤维素为固定化介质的rCMTI-I亲和纯化介质,建立了rCMTI-I的分离纯化工艺,研究了rCMTI-I对肿瘤细胞增殖的影响,并研究了rCMTI-I对明胶酶的作用。研究内容与结果主要有以下几个方面。1.rCMTI-I亲和层析介质的制备首先用环氧氯丙烷活化柱层析用微晶纤维素,并以胰蛋白酶为配基交联于其上获得了亲和层析介质,同时考察了微晶纤维素的最佳活化条件以及制备微晶纤维素亲和层析介质最佳胰蛋白酶用量。最佳活化条件为1:1的2.4mol/L NaOH溶液与DMSO（体积比）作为混合溶剂,活化温度为30℃,活化时间3h环氧氯丙烷的用量为20ml/g时环氧基密度最大。在最佳活化条件下,每克微晶纤维素的环氧基含量为（302.4908±10）μmol/g。2.rCMTI-1分离纯化工艺的研究用所制备的亲和层析介质从含有rCMTI-I的培养基上清中直接分离纯化rCMTI-I。通过Sephadex G-10层析对获得的亲和层析洗脱液冷冻干燥品进行脱盐,再用Sephadex G-25层析进一步纯化,采用Tricine-SDS PAGE以及抑制活力测定对活性蛋白峰进行追踪,获得了基本纯化的rCMTI-I。与用阳离子交换剂和阴离子交换剂作为纯化介质相比,亲和层析介质纯化效果较好。3.rCMTI-I对肿瘤细胞增殖的影响研究了rCMTI-I对肿瘤细胞增殖的影响,发现rCMTI-I对卵巢癌SKOV3细胞和SE-2肿瘤细胞的增殖有非常明显的抑制作用,并且这种抑制呈明显的剂量—效应关系,在浓度为3.82×102μmol/ml时rCMTI-I对两种肿瘤细胞的增殖抑制率分别为69.3%和86.5%。本结果预示着rCMTI-I有抗肿瘤作用。4.rCMTI-I对肿瘤细胞增殖的影响采用琥珀酰明胶法测定rCMTI-I对明胶酶的作用,显示rCMTI-I具有抑制明胶酶的活性,揭示rCMTI-I可能具有抑制明胶酶降解基底膜抑制肿瘤转移的作用。本研究取得的主要研究成果有:（1）研究制备了偶联有胰蛋白酶的柱层析用微晶纤维素亲和层析介质,并在此基础上研究建立了从工程菌发酵表达的上清液中分离纯化rCMTI-I的工艺,该工艺适合规模化生产。（2）研究发现rCMTI-I具有抑制肿瘤细胞增殖的活性,揭示rCMTI-I可能具有抗肿瘤作用。（3）采用琥珀酰明胶法测定rCMTI-I对明胶酶的作用,显示rCMTI-I具有抑制明胶酶的活性,揭示rCMTI-I可能具有抑制明胶酶降解基底膜抑制肿瘤转移的作用。本研究对小分子活性肽的表达、分离纯化具有指导意义,为rCMTI-I的药用开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1 CMTI家族介绍
• 2 CMTI的结构以及蛋白酶.抑制剂复合物的研究
• 3 CMTI的酶学特性
• 3.1 CMTI的作用机制
• 3.2 蛋白酶-抑制剂复合物
• 1位'>3.3 P₁位
• 4 CMTI的应用
• 5 TI的分离纯化方法
• 5.1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法
• 5.2 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
• 5.3 根据蛋白质带电性质进行分离
• 5.4 根据配体特异性的分离方法一亲和色谱法（AFFINITY CHROMATOGRAPHY,AC）
• 6 本课题拟研究的问题
• 第二章 RCMTI-Ⅰ亲和层析介质的制备
• 1 材料
• 1.1 试剂及溶液配制
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 溶液配制
• 1.2 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 微晶纤维素（MCC）的活化
• 2.1.1 微晶纤维素的活化反应
• 2.1.2 残留环氧氯丙烷的测定
• 2.1.3 FTIR对活化微晶纤维素的表征
• 2.1.4 环氧基修饰密度的定量分析
• 2.2 微晶纤维素活化条件的确定
• 2.2.1 环氧氯丙烷用量对纤维素上环氧基含量的影响
• 2.2.2 氢氧化钠浓度对纤维素上环氧基含量的影响
• 2.2.3 反应时间对纤维素上环氧基含量的影响
• 2.2.4 温度对纤维素上环氧基含量的影响
• 2.3 微晶纤维素作为亲和吸附载体的制备
• 2.3.1 胰蛋白酶活力的测定
• 2.3.1.1 标准曲线的制定
• 2.3.1.2 胰蛋白酶活力的测定
• 2.3.2 亲合层析介质的制备
• 2.3.2.1 亲合层析介质的制备
• 2.3.2.2 亲合层析介质交联率的测定
• 2.3.3 制备微晶纤维素亲和层析介质最佳胰蛋白酶用量的确定
• 3 结果
• 3.1 微晶纤维素活化条件的确定
• 3.1.1 环氧氯丙烷用量对纤维素上环氧基含量的影响
• 3.1.2 氢氧化钠浓度对纤维素上环氧基含量的影响
• 3.1.3 反应时间对纤维素上环氧基含量的影响
• 3.1.4 温度对纤维素上环氧基含量的影响
• 3.2 环氧氯丙烷环氧基修饰密度的定量分析
• 3.3 FTIR对活化微晶纤维素的表征
• 3.4 微晶纤维素（MCC）作为亲和吸附载体的制备
• 3.4.1 胰蛋白酶活力的测定
• 3.4.1.1 标准曲线
• 3.4.1.2 胰蛋白酶活力的测定
• 3.4.2 亲和层析介质的交联率
• 3.4.3 制备微晶纤维素亲和层析介质最佳胰蛋白酶用量确定
• 4 讨论
• 第三章 RCMTI-Ⅰ表达及其分离纯化工艺的研究
• 1 材料
• 1.1 试剂及溶液配制
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 溶液配制
• 1.2 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 RCMTI-Ⅰ的表达
• 2.1.1 菌种的纯化和扩增
• 2.1.1.1 YPD培养基
• 2.1.1.2 固体培养基
• 2.1.1.3 发酵培养基
• 2.1.1.4 菌种的纯化
• 2.1.1.5 种子液的制备
• 2.1.1.6 菌种的扩增
• 2.1.2 RCMTI-Ⅰ的表达
• 2.1.3 RCMTI-Ⅰ表达和上清抑制活力的初步测定
• 2.1.3.1 表达上清动态抑制活性测定
• 2.1.3.2 TRICINE-SDS-PAGE测RCMTI-Ⅰ的表达
• 2.2 RCMTI-Ⅰ的分离纯化
• 2.2.1 亲和层析介质对目的蛋白的分离纯化
• 2.2.2 层析柱的最大上样量
• 2.2.3 亲和洗脱样品的脱盐
• 2.2.4 目的蛋白的鉴定
• 2.2.4.1 RCMTI-Ⅰ静态抑制活性测定
• 2.2.4.2 目的蛋白的鉴定
• 2.2.5 亲和层析样品的纯化
• 2.2.5.1 纯化样品的静态抑制活性测定
• 2.2.5.2 纯化样品的TRICINE-SDS-PAGE
• 2.2.5.3 RCMTI-Ⅰ精确分子量的测定
• 2.3 其他方法对RCMTI-Ⅰ的分离纯化
• 2.3.1 DEAE-纤维素对RCMTI-Ⅰ的分离纯化
• 2.3.2 羧甲基纤维素CM-Ⅱ对RCMTI-Ⅰ的分离纯化
• 3 实验结果与分析
• 3.1 RCMTI-Ⅰ表达和上清抑制活力的初步测定
• 3.1.1 RCMTI-Ⅰ表达
• 3.1.2 RCMTI-Ⅰ表达上清抑制活力的初步测定
• 3.2 RCMTI-Ⅰ的分离纯化
• 3.2.1 亲和层析柱层析分离
• 3.2.2 层析柱最大上样量
• 3.2.3 亲和洗脱样品的脱盐
• 3.2.4 SEPHADEX G-10脱盐样品的抑制活力测定
• 3.2.5 亲和层析样品的进一步纯化
• 3.2.6 RCMTI-Ⅰ动态抑制活性的测定
• 3.2.7 TRICINE-SDS-PAGE
• 3.2.8 RCMTI-Ⅰ精确分子量的测定
• 3.2.9 DEAE-纤维素对RCMTI-Ⅰ的分离纯化
• 3.3 羧甲基纤维素CM Ⅱ对RCMTI-Ⅰ的分离纯化
• 4 讨论
• 第四章 RCMTI-Ⅰ对肿瘤细胞增殖的影响
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 细胞株
• 1.3 仪器
• 1.4 溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 RCMTI-Ⅰ对SKOV3细胞增殖作用研究
• 2.1.1 SKOV3细胞的复苏
• 2.1.2 SKOV3细胞的传代
• 2.1.3 MTT法测SKOV3细胞增殖
• 2.1.4 数据处理
• 2.2 RCMTI-Ⅰ对SE-2细胞增殖作用研究
• 2.2.1 SE-2细胞的复苏
• 2.2.2 SE-2细胞的传代
• 2.2.3 MTT法测SE*2细胞增殖
• 2.2.4 数据处理
• 3 实验结果与分析
• 3.1 RCMTI-Ⅰ对人卵巢黏液囊腺瘤细胞SKOV3生长的影响
• 3.2 RCMTI-Ⅰ对SE-2细胞生长的影响
• 4 讨论
• 第五章 RCMTI对明胶酶的作用
• 1 试剂与仪器
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 2 实验方法与结果
• 2.1 琥珀酰化明胶的制备
• 2.2 明胶酶抑制活性的测定
• 2.3 明胶酶抑制活性的测定结果
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表