高赖氨酸蛋白基因在转基因生菜中的表达和遗传研究

论文摘要

本实验在研究生菜（Lactuca sativa L）组织培养再生体系的基础上,优化了以子叶为外植体的遗传转化体系。通过叶盘与根癌农杆菌共培养,将高赖氨酸蛋白基因导入生菜,获得了转基因T1 代和T2 代植株。具体结果如下: 优化了生菜的遗传转化体系。外植体首先在芽分化培养基上预培养1d,然后感染含高赖氨酸蛋白基因的植物表达载体的根癌农杆菌。共培养2～3d 后,移入含有100mg/L 卡那霉素、500mg/L 羧苄青霉素的芽分化培养基上筛选转化植株。转化再生芽长至2cm时,移入含相同浓度抗生素的生根培养基生根,形成完整植株。对影响生菜转化频率的诸因素,包括外植体的苗龄、农杆菌的生长状态、外植体的预培养时间、浸染时间、共培养时间等进行了研究。研究结果表明:2～3d 苗龄的子叶是生菜进行遗传转化较理想的外植体材料;处在对数生长期的农杆菌活力最高,浸染能力最强;当农杆菌稀释至OD600=0.6 左右时,浸染时间以20min 为好;浸染前,外植体预培养1～2d,有利于转化频率的提高;适当的共培养时间（2～3d）也大大提高生菜的转化频率。对选择培养基上生根的抗性苗进行的Southern blot 检测结果表明,高赖氨酸蛋白基因已整合到T0 代生菜基因组;用RT-PCR 技术检测表明,目的基因在转化再生植株中能够正常转录。对T0 代转基因生菜植株赖氨酸（Lys）含量测定分析表明,赖氨酸有不同程度的提高,最高的可达9.46%;对T1 代转基因生菜植株进行的PCR 检测结果表明,目的基因能够遗传,但遗传率很低。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 1.1 植物转基因研究历史回顾
• 1.2 转基因植物应用情况简述
• 1.2.1 培育转基因抗虫作物
• 1.2.1.1 Bt毒蛋白基因
• 1.2.1.2 植物凝集素基因
• 1.2.1.3 蛋白酶抑制剂基因
• 1.2.1.4 淀粉酶抑制剂基因
• 1.2.2 培育抗除草剂植物
• 1.2.3 培育抗病毒植物
• 1.2.4 培育抗逆境植物
• 1.2.5 培育改良品质的农作物
• 1.3 植物蛋白质改良基因工程研究进展
• 1.3.1 蛋白质序列的修饰
• 1.3.2 人工合成优质蛋白基因
• 1.3.3 异源优质蛋白基因的转移和过量表达
• 1.3.4 同源优质蛋白基因的过量表达
• 1.3.5 增加游离的必需氨基酸的含量
• 1.4 生菜转基因研究现状
• 1.5 提高作物赖氨酸（Lys）含量所采取的方法
• 1.6 赖氨酸（Lys）基因研究进展
• 1.7 转基因植物的生物安全性
• 第二部分 本研究目的、意义和技术路线
• 第三部分 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 植物材料
• 3.1.3 酶与试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 主要基本培养基的配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 生菜遗传转化体系的建立及优化
• 3.2.1.1 消毒时间对种子发芽的影响
• 3.2.1.2 浸染时间对转化的影响
• 3.2.1.3 共培养时间对转化的影响
• 3.2.1.4 卡那霉素选择压的确定
• 3.2.1.5 羧苄青霉素（Carb）选择压的确定
• 3.2.1.6 植株再生及再生植株的管理
• 3.2.2 高赖氨酸基因对生菜的遗传转化及抗性植株的筛选
• 3.2.2.1 根癌农杆菌浸染液的准备
• 3.2.2.2 浸染与转化
• 3.2.2.3 抗性愈伤组织的诱导和筛选
• 3.2.2.4 抗性植株的获得
• 3.2.3 转基因生菜植株的检测
• 3.2.3.1 植株基因组DNA的提取
• 3.2.3.2 转基因植株PCR检测
• 3.2.3.3 转基因植株的Southernblot检测
• 3.2.3.4 植株总RNA的提取
• 3.2.3.5 转基因植株RT-PCR检测
• 3.2.3.6 转基因植株赖氨酸含量检测
• 第四部分 结果与分析
• 4.1 生菜遗传转化体系的建立
• 4.1.1 种子消毒试剂和时间
• 4.1.2 浸染时间对抗性芽的影响
• 4.1.3 共培养时间
• 4.1.4 抗生素选择压的确定
• 4.1.5 羧苄青霉素（Carb）对子叶外植体再生的影响
• 4.1.6 植株再生及再生植株的管理
• 4.2 T0代转基因生菜植株的分子检测
• 4.3 T0代转基因生菜植株赖氨酸含量分析
• 4.4 高赖氨酸蛋白基因在生菜中的遗传稳定性
• 第五部分 讨论
• 5.1 影响生菜遗传转化的因素
• 5.1.1 农杆菌浸染液
• 5.1.2 子叶外植体的叶龄
• 5.1.3 预培养
• 5.1.4 浸染时间
• 5.1.5 共培养
• 5.1.6 其他因素
• 5.2 生菜转化植株的筛选
• 5.2.1 外植体在卡那霉素选择培养基上生长和芽分化
• 5.2.2 转化苗在卡那霉素生根培养基上生根
• 5.2.3 抗性植株总DNA的PCR扩增
• 5.2.4 阳性植株Southernblot分析
• 5.2.5 阳性植株RT-PCR分析
• 5.3 高赖氨酸蛋白基因在生菜中的表达量和遗传稳定性
• 第六部分 小结
• 参考文献
• 英文缩略词
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介
• 独创性声明