抗原冲击树突状细胞介导CTL特异性抗白血病作用的体外研究

论文摘要

目的:研究白血病患者骨髓来源的单个核细胞体外诱导为树突状细胞的有效方法;观察不同途径来源的白血病抗原冲击树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性的抗白血病效应,为急性髓性白血病免疫治疗提供理论依据。方法:10例急性髓性白血病患者骨髓经淋巴细胞分离液分离单个核细胞,予重组人粒巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、钙离子载体A23187联合培养6天诱导分化为树突状细胞;分别用弱酸洗脱法提取单个核细胞MHC-I类抗原肽以及用0.4%KCl低渗法提取的白血病抗原,冲击树突状细胞,形成负载抗原的AML-DC;抗原与树突状细胞共培养6天后与正常人外周血分离的、经IL-2培养的T细胞共同培养,生成特异的细胞毒性T淋巴细胞;采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）比较不同方法产生的CTL细胞对急性髓性白血病细胞的杀伤活性。用倒置显微镜观察AML-DC诱导前后形态学变化,用流式细胞仪检测急性髓性白血病细胞诱导前后CD1α、CD83表型变化以及刺激T细胞后其CD152的表达。结果:白血病患者骨髓来源的单个核细胞经过100ng/ml GM-CSF、500ng/ml钙离子载体A23187成功诱导为树突状细胞,倒置显微镜下观察具有典型的树突状细胞形态;其CD1α、CD83表达诱导前分别为1.16±0.15%、7.28±0.21%,CD83诱导后48h最高,达59.69±2.56%,较诱导前差别有统计学意义,以后逐渐降低,CD1α则在96h达最高,较诱导前明显升高,有统计学意义;弱酸洗脱法获得的抗原肽冲击树突状细胞致敏T细胞后杀伤白血病细胞的能力最高,为76.65±12.62%,未负载抗原的树突状细胞致敏T细胞后杀伤白血病细胞的能力为29.63±5.49%,两者存在显著性差异（P<0.01）,空白对照组最低,为10.27±2.84%。结论:急性髓性白血病患者来源的骨髓单个核细胞经GM-CSF、钙离子载体A23187能够成功诱导为树突状细胞;弱酸洗脱法获得的抗原肽冲击树突状细胞致敏T细胞能够获得更强的杀伤白血病细胞的能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料
• 2.1 主要实验仪器和器材
• 2.2 试剂
• 2.3 实验对象
• 第3章 方法
• 3.1 实验流程
• 3.2 急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞的制备
• 3.3 靶细胞的冻存
• 3.4 白血病抗原的制备
• 3.5 树突状细胞的培养
• 3.6 抗原冲击树突状细胞
• 3.7 树突状细胞诱导前后免疫表型的鉴定
• 3.8 树突状细胞来源的鉴定
• 3.9 效应细胞（CTL）的分离培养及鉴定
• 3.10 靶细胞的复苏
• 3.11 效应细胞对靶细胞杀伤活性的检测
• 3.12 统计学处理
• 第4章 结果
• 4.1 细胞活力的检测
• 4.2 树突状细胞形态的观察
• 4.3 树突状细胞染色体的检测
• 4.4 AML-DC 诱导前后CD1Α、CD83 的变化
• 4.5 AML-DC 体外诱导CTL 的能力
• 4.6 CTL 细胞对白血病靶细胞的杀伤率
• 第5章 讨论
• 5.1 肿瘤免疫治疗的理论基础
• 5.2 树突状细胞的生物学特性
• 5.3 白血病来源树突状细胞的诱导方法
• 5.4 抗原冲击树突状细胞的方式
• 5.5 肿瘤抗原特异性CTL 的培养及AML-DC 致敏T 细胞后T 细胞的活化
• 5.6 CTL 杀伤肿瘤靶细胞的机制
• 5.7 目前存在的问题
• 第6章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果