高血糖促心脏连接蛋白43磷酸化及其对连接通道功能的影响

论文摘要

心脏间隙连接通道是心肌细胞之间的特殊连接通道,其功能是完成心肌细胞之间的电化学信息交换,其功能的异常与心律失常的发生有密切关系。心室间隙连接通道主要由连接蛋白43组成。间隙连接通道的功能主要受胞内pH值、胞内Ca2+浓度、连接蛋白磷酸化状态、跨通道电压的调控。新近的一些研究表明高血糖可以促间隙连接通道连接蛋白43磷酸化并使其功能发生改变。但高血糖促连接蛋白43磷酸化的具体位点及其机理尚不清楚。高血糖可以激活蛋白激酶C,而蛋白激酶C又可以使连接蛋白43羧基末端丝氨酸磷酸化,据此推测高血糖可能通过使连接蛋白43羧基末端丝氨酸磷酸化而改变其调控功能。由此,本课题组拟应用基因点突变、抗原再现技术来研究高血糖对间隙连接通道连接蛋白43的促磷酸化作用及其机制,如果能阐明高血糖致心脏间隙连接通道功能异常的机制,那将有助于阐明糖尿病患者心律失常的发生机理并为预防及治疗糖尿病并发心律失常开辟另一崭新的方向。本研究首先通过构建pcDNA3-野生型连接蛋白43质粒（Wt-Cx43-pcDNA3）、pcDNA3-突变型连接蛋白43质粒（S262F-Cx43-pcDNA3,S368A -Cx43-pcDNA3）,分别转染HeLa细胞,经G418筛选后得到表达相应连接蛋白43的细胞株（Wt-Cx43-HeLa细胞,S262F-Cx43-HeLa细胞,S368A -Cx43-HeLa细胞）。应用上述细胞株分两部分进行细胞学实验。第一部分是在筛选后细胞株的培养基中加入不同浓度的葡萄糖（5mmol/L,25mmol/L）,应用抗磷酸化Cx43特异性抗体或应用Cx43位点磷酸化抗体通过细胞免疫化学,细胞免疫荧光,及免疫印迹分析Cx43磷酸化情况。对比分析不同葡萄糖浓度对Cx43磷酸化的影响及磷酸化位点。第二部分通过应用Lucifer Yellow划痕试验检测高血糖间隙连接通道功能的改变。结果表明:1,高血糖能促使Cx43磷酸化;2,应用抗连接蛋白43磷酸化特异性位点的抗体（p-connexin43-Ser368和p-connexin43-Ser262）进行细胞免疫荧光,Western bloting,结果表明高血糖促使连接蛋白43的Ser368位点磷酸化,而对Ser262的无磷酸化作用;3,应用Lucifer Yellow划痕试验检测间隙连接通道功能的改变,结果表明高血糖能降低间隙连接通道传导。综上所述,本实验研究表明（1）高血糖可以促进Cx43的磷酸化,提高Cx43的磷酸化程度;（2）高血糖促使连接蛋白43的Ser368位点磷酸化;（3）高血糖能降低间隙连接通道传导,降低细胞GJ功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 常用缩略语说明
• 1 前言
• 1.1 间隙连接与连接蛋白
• 1.2 连接蛋白 43（Connexin43,Cx43）
• 1.3 Cx43 的磷酸化途径概述
• 2 材料与方法
• 2.1 试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 S262F 和 S368A 突变体的构建
• 3.2 转染 pcDNA3.0-Cx43 的 HeLa 细胞
• 4 讨论
• 4.1 Cx43 磷酸化
• 4.2 高血糖促 Cx43 磷酸化及其磷酸化位点
• 4.3 高血糖促 Cx43 磷酸化对 GJIC 功能的影响
• 5 结论与展望
• 6 参考文献
• 7 附录：发表文章（文献综述）
• 致谢
• 发表文章
• 个人简历